ALDH1和AQP-5蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達及與病理學參數、預后的關系

王秋 林川

非小細胞肺癌(NSCLC)作為常見的肺癌類型，占肺癌的80%以上[1]。癌細胞的侵襲、轉移是一個復雜的過程，也是導致患者治療失敗和死亡的主要原因之一[2,3]。隨著醫療科研水平的提高，更多研究證實，疾病的發生發展及預后與機體相關蛋白指標密切相關。乙醛脫氫酶1(ALDH1)是細胞內一種參與乙醛氧化的溶質酶，在多種基因的表達、組織分化及干細胞早期分化中發揮重要作用[4]。研究表明，ALDH1在多種腫瘤細胞中呈表達上調且影響患者預后[5,6]。水通道蛋白(AQPs)是存在于具有分泌和吸收功能的上皮細胞中能夠轉運水的特異孔道，哺乳動物中包含多種亞型，其中AQP-5被發現在多種癌癥組織中高表達，與淋巴轉移及預后不良有關[7,8]。因此本研究擬分析ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織中的表達，并探討其與臨床病理學參數、預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月至2013年12月我院手術切除的160例經病理學證實為NSCLC患者的組織標本及其癌旁正常組織標本。所有入選患者在術前未進行放化療和其他治療且3年隨訪資料完整。160例NSCLC患者，男104例，女56例；年齡25～83歲，平均年齡(48.32±12.23)歲；參照國際抗癌聯盟TNM分期標準2009版[9]：Ⅰ期患者20例，Ⅱ期患者58例，Ⅲ期患者78例，Ⅳ期患者4例；腫瘤直徑<2 cm 完整70例，≥12 cm 90例；病理類型：腺癌64例，鱗癌96例；組織學分級：高分化患者16例，中分化患者120例，低分化患者24例；共有98例發生區域淋巴結轉移。所有組織標本在4%中性甲醛中固定，然后常規取材石蠟包埋，用于后續免疫組織化學法檢測。

1.2 抗體與試劑盒 兔抗人ALDH1多克隆抗體、兔抗人AQP-5單克隆抗體購自上海長島生物技術有限公司，辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG購自上海滬峰化工有限公司，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒購自美國Abcam公司，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒采購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學檢測ALDH1、AQP-5蛋白表達 將收集的組織樣本固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進行修復，以充分暴露抗原決定簇。然后用3%的H2O2溶液室溫下浸泡10 min，封閉，分別加稀釋好的一抗4℃過夜孵育，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量DAB作用2～5 min后用去離子水終止反應，蘇木素復染1.5～2 min，清洗后于梯度乙醇中脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果。

1.4 病理切片陽性判定標準 由兩位經驗豐富的病理醫師對病理切片進行盲評。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)在光鏡下觀察，用陽性細胞染色強度和陽性細胞比例來判定染色結果[10]。染色強度評分：無顯色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以染色細胞的陽性比例評分<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述2項積分相乘，積分0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.5 隨訪 采用定期復查和電話相結合的方式，總生存時間(OS)為從手術至隨訪結束或者死亡時間。

1.6 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件，ALDH1、AQP-5在NSCLC組織和正常組織中表達的差異性及在腺癌與鱗癌、淋巴結是否轉移組間差異性用Mann-Whitney U秩和檢驗；在組織病理分級、臨床TNM分期組間表達的差異性用KruskalWallis H檢驗；等級變量之間的相關性采用Spearman相關分析；Kaplan-Meier分析ALDH1、AQP-5蛋白與NSCLC患者生存率之間的相關性；Cox回歸比例風險模型分析預后影響因素，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達 ALDH1、AQP-5蛋白主要表達于細胞核中，ALDH1在NSCLC組織和癌旁正常組織中陽性表達率分別為90.00%和25.00%，AQP-5在NSCLC組織和癌旁正常組織中陽性表達率分別為93.75%和17.50%，NSCLC組織中ALDH1和AQP-5陽性表達率明顯高于癌旁組織(P<0.001)。見表1，圖1。

表1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達 n=160，例

圖1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達(×400)

2.2 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織中表達的相關性 Spearman相關分析結果顯示ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織呈明顯的正相關關系(r=0.538，P<0.001)。見表2。

表2 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織中表達的相關性 例

2.3 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC臨床病理分組中表達的差異 ALDH1、AQP-5蛋白表達在腺癌和鱗癌間無統計學意義(P>0.05)，而在分化程度、TNM分期和淋巴結是否轉移間存在統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC臨床病理分組中表達的差異 例

2.4 ALDH1、AQP-5蛋白表達與NSCLC患者生存分析 84例ALDH1表達強度為++/+++的NSCLC患者，中位生存時間為18.5個月，76例CDK4表達強度為-/+的NSCLC患者，中位生存時間為39.4個月，ALDH1表達強度為-/+的NSCLC患者較表達強度為++/+++的NSCLC患者的生存時間明顯延長，差異有統計學意義(P=0.0018)；72例AQP-5表達強度為-/+的NSCLC患者，中位生存時間為40.5個月，88例AQP-5表達強度為++/+++的NSCLC患者，中位生存時間為21.7個月，AQP-5表達強度為-/+的NSCLC患者較表達強度為-/+的NSCLC患者的生存時間明顯延長，差異有統計學意義(P=0.0224)。見圖2。

圖2 ALDH1、AQP-5蛋白表達與NSCLC患者生存分析

2.5 Cox比例風險回歸模型分析影響NSCLC臨床預后的因素 單因素回歸分析顯示：分化程度、TNM分期、淋巴結是否轉移及ALDH1與AQP-5的表達是影響NSCLC臨床預后的因素(P<0.05)；對以上影響NSCLC預后的因素進行多因素回歸分析，結果顯示TNM分期、ALDH1和AQP-5表達是影響NSCLC預后的風險因素。見表4。

表4 Cox比例風險回歸模型分析影響NSCLC臨床預后的因素

3 討論

肺癌是臨床最為常見的腫瘤之一，由于發病比較隱匿，在早期并沒有特殊的癥狀，所以確診時一般多屬中期或者晚期，已經不能進行手術切除或者局部放療，且其預后較差[11]，給患者的家庭和社會均帶來沉重的負擔，因此尋找新的腫瘤標志物，及早診斷及早治療成為科研工作者探尋的熱點。

ALDH1在人類細胞表達于胞質中，基因位于9q21 染色體上，是ALDH 家族成員之一。ALDH溶質酶在代謝過程中能將醛類氧化為相應的羧酸從而解除機體毒素，主要底物視黃醛在ALDH的催化下可以氧化為維甲酸以調控基因表達及細胞分化。ALDH1蛋白近年來已陸續被發現可作為多種腫瘤干細胞標志物，如胰腺癌、乳腺癌、胃癌及卵巢癌等[12,13]。本研究結果顯示ALDH1在NSCLC組織中陽性表達率為90.00%，明顯高于癌旁正常組織，提示ALDH1有望作為腫瘤標志物為NSCLC的診治提供指導。另外ALDH1的陽性表達與NSCLC的分化程度、TNM分期和淋巴結轉移相關，表明ALDH1表達呈陽性的患者，分化程度低，TNM分期高且易于轉移，從而促進NSCLC病程進展，使腫瘤惡性程度高，侵襲和轉移能力強。AQP-5廣泛分布于多種細胞中，該基因在人類位于12q3染色體上，AQP-5蛋白分子量大小21～24，其作用主要是轉運水分子，維持機體水分平衡并參與調節生理活動。AQP-5的高豐度表達在細胞周期中發揮重要作用，能夠促進增殖抑制凋亡[14]。研究表明AQP-5與多種惡性腫瘤的發生發展關系密切，在結腸癌和直腸癌組織中的表達明顯高于正常組織[15]，本研究結果顯示AQP-5蛋白主要表達于細胞核中，癌組織中表達明顯高于正常組織，在分化程度、TNM分期和淋巴結是否轉移間存在統計學意義，即AQP-5表達與分化程度呈負相關，而與TNM分期和淋巴結轉移呈正相關，提示AQP-5高表達和NSCLC細胞侵襲、易發生轉移和預后較差等特點相關，可以作為評價NSCLC發生發展的指標。本研究還發現ALDH1和AQP-5在NSCLC組織中呈明顯的正相關關系，進一步的說明ALDH1過表達能夠促進NSCLC細胞增殖，也可作為評價NSCLC發生發展的指標。生存分析結果顯示ALDH1和AQP-5表達強度為-/+的NSCLC患者中位生存期較表達強度為++/+++的患者明顯延長，差異具有統計學意義。提示ALDH1和AQP-5過表達均能明顯降低NSCLC患者的生存期，Cox分析結果顯示ALDH1和AQP-5均是影響NSCLC預后的風險因子，提示ALDH1和AQP-5會促進NSCLC的發生發展。

綜上所述，ALDH1和AQP-5過表達可促進NSCLC的發生發展，降低NSCLC患者的生存期，聯合監測ALDH1和AQP-5的表達對NSCLC的發生發展有一定的臨床價值。