老年帕金森病與腸道菌群、短鏈脂肪酸和炎性因子相關性研究

李劍蘭 余璇 胡青婷 左丹丹

PD是一種神經系統退行性疾病，與環境和遺傳因素密切相關。研究表明，腸道菌群與中樞神經系統(central nervous system，CNS)之間存在相互作用[1-3]。腸道菌群有助于調節腸胃蠕動，促進營養吸收和代謝，調節黏膜免疫功能并維持腸道健康。胃腸道功能障礙在PD病人中早于運動癥狀的發生，被認為是PD的早期癥狀[4-5]。腸道菌群可能將腸道作為載體，將病變擴散至中樞神經系統，從而導致PD的發生發展[6]。此外，某些腸道產短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFAs)細菌豐度水平與PD之間密切相關，而SCFAs可調節腸神經系統(ENS)的活性，從而增加腸胃蠕動，改善PD的早期癥狀[7]。此外，SCFAs還具有調節免疫、改善炎性反應的作用[8]。PD與腸道菌群的相關性研究已有報道，但PD是否與SCFAs和炎癥因子之間存在相關性鮮有報道。本文選取人腸道梭菌簇IV和梭菌簇XIVa兩大優勢菌群中產SCFAs細菌普拉梭菌(F.prausnitzii)和直腸真桿菌(E.rectale)，以及腸道益生菌雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳酸菌(Lactobacillis)，分析腸道菌群、SCFAs和炎性因子與PD的關系，探討PD發病及進展的可能機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年4月至2019年4月入住我院神經內科的PD病人，同時選取同一時間段我院年齡、性別與之相匹配的健康體檢者作為對照組。PD組25例，男12例，女13例，年齡60～80歲，平均(68.34±6.15)歲。對照組25例，男15例，女10例，年齡60～80歲，平均(69.89±7.33)歲。納入標準：(1)PD由專科醫生進行確診，嚴格按照帕金森病協會PD診斷標準[9]；(2)年齡≥60歲。排除標準：(1)近3個月內服用抗生素和微生態制劑；(2)近1年發生過非創傷性感染、過敏、免疫異常疾病；(3)有手術及其他應急情況人群；(4)排便習慣異常；(5)有明顯肝、腎功能損害，慢性腸胃功能紊亂，有腹瀉、膽道感染病史和腸炎等胃腸道疾病[10]。所有研究對象知情同意，并進行帕金森綜合評分量表(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale, UPDRS)評估。UPDRS包括精神、行為和情緒，日常活動，運動功能，治療的并發癥4個方面，分值越高，PD病人病情越嚴重。

1.2 儀器與試劑 實時熒光定量儀(Bio-rad IQ5，美國)，實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)，凝膠成像儀(Bio-rad，美國)，糞便細菌DNA提取試劑盒(凱杰，德國)，TNF-α、IL-6和IL-10試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司，貨號：YBC102g；YBA079Ov01；YBA056Bo01)。所用引物如表1所示，所有引物由上海生工合成。

表1 16S rDNA基因實時熒光定量PCR定量腸道菌群引物

1.3 糞樣采集及腸道菌群定量 收集2組研究人群早起空腹中段糞便，裝入無菌的糞樣收集管中，并標記日期、分組和姓名，置于液氮罐中后，裝入-80 ℃冰箱保存。將收集的糞樣進行16S rDNA基因實時熒光定量PCR定量檢測，檢測腸道菌群包括F.prausnitzii、E.rectale、Bifidobacterium、Lactobacillis，檢測方法參照文獻[10]。采用糞樣細菌DNA提取試劑盒提取糞樣細菌總DNA，吸取2μL作為擴增樣本，分別加入各目標細菌引物進行PCR擴增，回收各細菌電泳條帶作為陽性模板，采用絕對定量的實時熒光定量PCR法檢測各目標腸道細菌的拷貝數，使用Log(copies)表示。

1.4 SCFAs測定 精密稱取采集的早起空腹中段糞樣0.3 g，進行預處理，配置乙酸、丙酸和正丁酸標準品，采用火焰離子化檢測器，以氮氣為載氣，手動進樣，每次進樣量為1μL，運行18 min，通過與標準品保留時間對比定性，以峰面積定量計算糞樣乙酸、丙酸和正丁酸水平，具體步驟參考文獻[13]。

1.5 血樣采集及炎性因子測定 收集2組研究對象早起空腹靜脈血，離心后，嚴格按照TNF-α、IL-6和IL-10試劑盒說明書進行檢測。

2 結果

2.1 2組UPDRS比較 與對照組相比，PD組病人UPDRS總得分明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2 2組腸道菌群比較 16S rDNA基因實時熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，PD組病人腸道E.rectale、F.prausnitzii和Lactobacillis水平明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；2組Bifidobacterium水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組人群UPDRS評分及腸道菌群比較

2.3 2組腸道SCFAs及血清炎癥因子水平比較 與對照組相比，PD組病人腸道丙酸、丁酸水平明顯降低，血清TNF-α、IL-6水平明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組人群腸道SCFAs和血清炎癥指標比較

2.4 UPDRS與腸道菌群、SCFAs及血清炎性因子水平的相關性 Spearman相關性分析結果顯示， UPDRS總得分與PD病人腸道E.rectale、F.prausnitzii、丙酸和丁酸水平呈負相關(P<0.05)，與血漿TNF-α和IL-6水平呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 UPDRS與腸道菌群、SCFAs及炎性因子的相關性(r)

3 討論

PD是最常見的神經退行性疾病之一。ENS通過迷走神經與大腦雙向通信，因此迷走神經是腦-腸軸的重要連接部分。腸道中微生物群組可以在腦-腸軸上發揮重要作用，通過影響ENS和CNS的神經元功能來發揮作用，成為胃腸道與CNS之間的雙向交流系統。腸道菌群組和微生物代謝產物可參與新陳代謝并影響宿主健康，尤其在認知、行為和免疫方面。

研究表明，PD病人和健康對照者之間糞便微生物群的結構和豐度有所不同：與健康對照組相比，PD組糞樣中布勞特氏菌(Blautia)、類桿菌(Faecalibacterium)和胃球菌(Ruminococcus)屬水平顯著降低；而腸賀氏菌(Escherichia-Shigella)、鏈球菌(Streptococcus)、變形桿菌(Proteus)和腸球菌(Enterococcus)屬水平顯著升高[14-15]。本研究發現，與對照組相比，PD組腸道F.prausnitzii水平明顯降低，與文獻報道一致;另還發現PD組人群腸道E.rectale、Lactobacillis水平明顯降低。此外，本研究還發現UPDRS總得分與PD人群腸道E.rectale和F.prausnitzii水平呈負相關，從而驗證了腸道菌群與PD之間存在相關性。F.prausnitzii和E.rectale屬于產丁酸菌，是結腸中兩大優勢菌類，分別屬于梭菌簇IV和梭菌簇XIVa。與對照組相比，PD病人腸道中產生抑制炎癥丁酸鹽的Blautia、糞球菌(Coprococcus)、羅氏菌(Roseburia)和Faecalibacterium屬水平明顯減少，而具有促進炎癥的勞爾氏菌(Ralstonia)屬水平明顯升高[3]。腸道細菌可通過其合成神經遞質和產生具有神經活性的代謝產物(如SCFAs)來調節免疫系統活化的能力，影響CNS[16]。PD除與某些腸道菌群豐度密切相關，還與糞便SCFAs水平減少密切相關。SCFAs的降低可能會引起ENS的改變，并導致PD病人的胃腸動力異常，加劇PD的病情進展[17]。本研究發現，與對照組相比，PD組病人腸道丙酸和丁酸水平顯著降低。

SCFAs水平降低會損害腸道上皮屏障，從而使ENS更易受腔內病原體的侵害，導致炎癥發生。SCFAs已被認為是腸道微生物群對腸道免疫功能影響的潛在介質。大量證據證實了神經炎癥在PD病理中的作用，諸如小膠質細胞、星形膠質細胞、補體系統和細胞因子等炎性成分與CNS的神經炎癥有關。研究表明，與對照組相比，PD組炎性細胞因子IL-6和TNF-α表達增加[18]，與本文研究結果一致。此外，本研究還發現UPDRS總得分與PD病人血漿TNF-α和IL-6水平呈正相關，說明TNF-α和IL-6可能參與PD的發生發展進程，但機制尚不明確，還需進一步研究。

綜上所述，本研究推測PD病人出現胃腸道早期癥狀時，腸道菌群結構組成已發生變化，導致產SCFAs細菌水平降低，從而導致腸道SCFAs水平降低，增加體內炎癥反應，并通過腦-腸軸影響CNS，加劇PD的發生發展進程。但該作用機制還需進一步進行研究驗證。