超高效合相色譜-質譜法快速分析煙葉中游離脂肪酸

喻世濤，陶永峰，姚建武，魏 剛，高 頌，楊 鑫，唐向兵

（1.湖北中煙工業(yè)有限責任公司，武漢 430040；2.湖北新業(yè)煙草薄片開發(fā)有限公司，武漢 430056；3.重組煙葉應用技術研究湖北省重點實驗室，武漢 430040）

煙葉中有機酸、低級脂肪酸、高級脂肪酸及非揮發(fā)性的二元酸、三元酸等多與鉀、鎂、鈣等金屬離子或生物堿結合成鹽或以酯類的形式存在［1，2］。高級脂肪酸、飽和高級脂肪酸及其甲酯類能使煙氣柔滑、平衡煙氣的酸堿度、減輕煙草的刺激性、增加煙氣濃度的作用，但高級脂肪酸及其甲酯在抽吸時產(chǎn)生己醛、己烯醛等青雜氣物質［3，4］。故對煙草中非揮發(fā)性有機酸，尤其是高級脂肪酸及其衍生物的測定已逐漸成為國內外煙草行業(yè)的質量控制內容［5］。

對非揮發(fā)性有機酸的分析檢測，一般可以采用高效液相色譜、離子色譜、毛細管電泳等液相分離分析技術進行分析檢測［6-8］。由于煙草中化學成分種類較多，其中游離脂肪酸（FFA）的分離、檢測過程較為復雜。目前，常用的分析方法主要是氣相色譜/質譜法（GC/MS）［9-11］和液相色譜串聯(lián)質譜法（LC/MS/MS）［12］。但是，以上方法存在一定的不足［13-16］。在LC/MS方法中，雖然不需要進行樣品衍生化，但運行前的樣品制備過程費時費力，并且采用的毒性有機溶劑價格昂貴，處理費用較高。在典型的反相（RP）LC/MS 分析中，必須將所有含有脂肪酸的有機提取物蒸干，再使用相溶性更好的進樣溶劑進行復溶［17，18］。

本研究建立了一種利用帶有質譜分析的超高效合相色譜（簡稱UPC2/MS）快速測定煙葉中FFA 的方法。UPC2是一種互補的正交分離技術，并同時使用了氣體和液體作為流動相，具有較好的溶劑性和擴散性，同時兼容光學檢測器和MS 檢測器，是定性分析和定量分析的理想選擇［19-21］。正是這種流動相的合并以及更多的固定相選擇，使得UPC2成為科學家非常青睞的一種分析檢測工具。由于UPC2可以分析溶于有機溶劑（例如己烷和氯仿）中的樣品，大大簡化了樣品制備的要求，同時還保留了反相LC/MS的所有優(yōu)勢，對游離脂肪酸而非FAME（脂肪酸甲酯）衍生物的分析實現(xiàn)了更簡單快速的樣品制備，含有全部FFA 的有機相提取物可以直接注入系統(tǒng)中，顯著節(jié)省了樣品制備和分析時間、溶劑成本和溶劑棄置處理成本［22］。此外，還避免了衍生化步驟造成的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料

煙葉，湖北中煙工業(yè)有限責任公司；FFA 標準品，Sigma 公司；甲醇（色譜純）、二氯甲烷、（分析純），國藥集團化學試劑有限公司，其他試劑均為分析純。

超高效合相色譜質譜聯(lián)用儀（UPC2/MS）、JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，寧波新芝科技股份有限公司；3K15離心機，Sigma公司；BP211D電子天平，Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 混合標準溶液配制 用二氯甲烷制備5 μg/mL儲備液和100 ng/mL 的脂肪酸混合標準溶液，然后注入UPC2/MS 系統(tǒng)中進行分析。

1.2.2 樣品制備 稱取20 mg 已粉碎的煙草樣品于具Teflon 旋塞20 mL 試管（自制）中，加人10 mL 二氯甲烷超聲萃取5 min，4 000 r/min 離心，取上清液至100 mL 容量瓶中，加二氯甲烷定容至刻度，再取1 mL 至10 mL 容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，進樣分析。

1.2.3 分析條件

1）色譜條件。色譜系統(tǒng)ACQUITY UPC2；色譜柱HSS C18SB 1.8 μm，2.1 mm× 150 mm；流動相A 為CO2；流動相B 為含0.1%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脫程序見表1；流速0.6 mL/min；補償液含0.1% NH4OH的甲醇溶液（0.2 mL/min）；樣品溫度10 ℃；柱溫50 ℃；進樣體積0.5 μL。

2）MS 條件。質譜儀Xevo TQS；電離模式ESI-；毛細管電壓1.0 kV；錐孔電壓30 V；燃燒溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；錐孔氣體流速10 L/h；脫溶劑氣流速600 L/h；質譜掃描方式SIR。

表1 超高效合相色譜梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 異構體分析

由于FFA 的生物功能會根據(jù)雙鍵位置（如-3和-6）的不同而有所不同。對18∶3（Δ6，9，12）和18∶3（Δ9，12，15），以及20∶3（Δ8，11，14）和20∶3（Δ11，14，17）異構體進行分離試驗，色譜見圖1。結果表明，基于雙鍵位置不同的同量異構體分離效果滿足分離要求。FFA 標準品混合物分析結果見表2。

圖1 基于雙鍵位置的同量異位脂肪酸的離子色譜

2.2 洗脫梯度的優(yōu)化

圖2 顯示了碳鏈長度為C8至C24飽和FFA 的分離。ACQUITY UPC2高強度硅膠顆粒（HSS）C18SB 1.8 μm，2.1 mm× 150 mm 色譜柱提供了類RP 分離，可實現(xiàn)不同種類FFA 的有效分離。在酸性條件下，采用比例較小的甲酸（含0.1%甲醇溶液）運行梯度，以改善峰形并減少拖尾。

表2 FFA 標準品混合物分析結果

ACQUITY UPC2方法比GC/MS 和RPLC 方法快10 倍（運行時間僅需3 min），提升了整體效率，并且使用毒性小、更為經(jīng)濟的CO2作為溶劑。

2.3 檢測器選擇

由于高級脂肪酸疏水性較強，有一定的表面活性，負離子模式下質譜相應信號較強。因此該方法靈敏度遠高于其他方法。但由于高級脂肪酸多為直鏈，在串聯(lián)質譜中找不到碎片離子，不能采用MRM掃描模式，只能采用SIR 模式掃描。

因反相分離過程的雙重性質而存在的問題（脂肪酰基鏈中的雙鍵越多，保留時間就越短，而脂肪酰基鏈的長度越長，則保留時間也會越長）會妨礙實際樣品的分析；成分的種類數(shù)量通常很大，導致其鑒定因共洗脫而變得非常困難（圖3A 和圖3B）。采用質譜檢測器，不僅可以提高分析靈敏度，而且通過提取母離子質量數(shù)，可以減少共流出物的干擾，專屬性提高。

2.4 工作曲線、線性范圍、檢測限和定量限

分別精密量取標準品儲備液，用二氯甲烷制成系列濃度梯度的棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸混合標準溶液。在上述色譜條件下分別進樣0.5 μL，記錄峰面積。以峰面積Y 對濃度X（ng/mL）進行線性回歸計算，得到回歸方程，并按色譜響應S/N≥3 和S/N≥10 計算出各脂肪酸的檢測限和定量限（表3）。

圖2 不同洗脫溶劑梯度C8 至C24 游離脂肪酸的分離

2.5 精密度、穩(wěn)定性與重復性試驗

精密吸取供試品溶液0.5 μL，在上述色譜條件下連續(xù)進樣5次，棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸的峰面積RSD 分別為5.2%、6.8%、8.0%、6.2%、5.3%。取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、10 h 進樣分析，5種脂肪酸的峰面積RSD 分別為6.3%、7.5%、5.9%、6.8%、4.3%，表明10 h 內以上脂肪酸穩(wěn)定性良好。同一批樣品，平行取樣5 份，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，5 種脂肪酸的峰面積RSD 分別為4.6%、3.0%、5.9%、6.7%、4.4%。

圖3 32 種不同游離脂肪酸標準品混合物的分離

表3 5 種脂肪酸工作曲線、檢測限和定量限

2.6 回收率試驗

將棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸的混合標樣加入已知含量的同一煙葉樣品，按照制備供試品溶液方法平行制樣5 份，分別在上述色譜條件下進樣測定，5 種脂肪酸的平均回收率分別為97.2%、96.1%、96.6%、95.8%、95.9%，RSD 分 別 為4.3%、6.7%、6.2%、3.8%、3.9%。

2.7 樣品測定結果

分別取8 個樣品，制得樣品溶液8 份，5 種脂肪酸測定結果見表4。由表4 可知，采用UPC2/MS 法測定煙葉中游離脂肪酸的含量，重現(xiàn)性好、精確度高，測定值RSD 小于6%，結果較為穩(wěn)定，測定效率明顯提高。

表4 煙葉樣品中脂肪酸測定結果 （單位：mg/g）

3 討論

本研究建立了超高效合相色譜-質譜法快速分析8 種煙葉中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸5 種脂肪酸的方法，5 種脂肪酸在2.2～72.2 ng/mL具有較好的線性關系（r＞0.999），不同添加水平下的平均回收率為95.8%～97.2%，并對32 種游離脂肪酸標準品混合液進行了分析。8 種煙葉中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的含量在0.12～1.21 mg/g。對比現(xiàn)有研究結果，棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的含量存在不一致的情況［12，17］，可能是因為煙葉樣品的產(chǎn)地、年份、部位不同，但是以上5 種脂肪酸含量基本相近。

本方法無需進行FAME 衍生化，可直接測定游離脂肪酸，分析速度快，靈敏度高，選擇性強，且樣品前處理簡單，適用于煙葉中游離脂肪酸的測定分析。研究結果可為煙草中游離脂肪酸的測定提供快速高效的分析方法，也為煙草原料感官質量評價提供技術參考。