刺梨果渣中薔薇酸的提取工藝研究

劉英梟，袁小紅

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621000）

刺梨（Rosa roxbunghii Tratt.）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實，又名山王果、刺莓果、茨梨等，是一種滋補養身、稀有的營養珍果［1-3］。刺梨作為貴州省特色食品資源，含有豐富的維生素、黃酮、三萜、多糖類化合物。每100 g 刺梨果肉中含有2 500 mg左右的維生素C，是蘋果、梨等含量的500 倍，被稱作“VC 之王”［4］。有研究表明，野生刺梨中總黃酮含量為0.746%，總三萜含量為2.578%［5］。貴州省刺梨集中連片種植面積約10 萬hm2，種植規模全國第一。據貴州日報報道，貴州省預計到2021 年刺梨種植面積在現有基礎上將新增4 萬hm2，年產鮮果50 萬t，綜合產值達到100 億元［6］。目前來看，刺梨果渣的利用度較低，以刺梨提取物制造藥品，可以大大提高刺梨的利用度，實現刺梨產品常態化［7］。

五環三萜類化合物是以6 個異戊二烯構成的萜類化合物，在自然界中分布廣泛［8］。刺梨中含有大量的五環三萜酸，如齊墩果酸、熊果酸、薔薇酸［9，10］等。它們均具有多種重要的生物活性，如抗炎［11］、抗腫瘤［12，13］、保肝護肝［14-16］、治療胃潰瘍［17］等。

目前從刺梨中提取黃酮、三萜類化合物常用方法為超聲提取、微波輔助提取、水浴提取等［18-20］。查閱文獻未發現有通過堿提酸沉法從刺梨中提取五環三萜類化合物的方法，也沒有關于用響應面法優化刺梨中薔薇酸提取工藝的研究報道。堿提酸沉法相對于傳統提取方法節約成本、對環境友好。本研究以薔薇酸得率為目標值，采用單因素試驗和響應面試驗研究刺梨果渣中薔薇酸的提取工藝，旨在為薔薇酸的工業化生產提供參考依據。（表1）。提取液經抽濾、減壓濃縮，用80%乙醇溶解，溶液經微孔濾膜過濾后按“1.3.2”方法測定后計算薔薇酸得率。

表1 單因素試驗設計

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮刺梨購自貴州省六盤水市刺梨種植基地，經西南科技大學袁小紅教授鑒定為薔薇屬植物刺梨。

1.2 儀器與試劑

榨汁機，九陽電器有限公司；電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；R-210 型旋轉蒸發儀，瑞士BUChI 公司；SHB-Ⅲ型循環水式真空泵，鄭州長城科工貿公司；高效液相色譜儀，Agilent Technol?ogies Inc.。

薔薇酸標準品，滁州仕諾達生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse XDBC18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇+0.5%磷酸水溶液（80∶20）；柱溫35 ℃；檢測波長210 nm；流速1 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.2 薔薇酸標準曲線 準確稱取1 mg 薔薇酸標準品，用1 mL 甲醇超聲溶解于離心管中，稀釋配制質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的標準溶液。分別取各濃度標準品10 μL 注入色譜儀，在“1.3.1”的色譜條件下測定，得到標準品的高效液相色譜。以標準品濃度（mg/mL）為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得標準曲線回歸方程：y=9 629.4x-7.539 5，R2=0.999 8，線性范圍0～1.0 mg/mL。薔薇酸得率計算公式如下。

式中，m1為刺梨果渣粉末的質量，g；m2為薔薇酸的質量，g。

1.3.3 提取工藝研究

1）單因素試驗。準確稱取0.6 g 刺梨果渣粉末于20 mL 試管內，加入一定比例、一定pH 的堿液，設置水浴鍋溫度進行提取（以上試驗均設置3 個重復）

2）響應面試驗。使用Design Export 8.0 軟件中的Box-Behnken 中心組合設計優化提取條件（表2），在單因素試驗基礎上，考察提取溫度、堿液pH、液固比3 個因素對響應值得率的影響。1.3.4 純化工藝研究

表2 響應面試驗因素與水平

1）酸沉pH單因素試驗。準確稱取5份刺梨果渣粉末于試管中，每份0.6 g，加入12 mL 堿液調pH 至12，水浴鍋70 ℃提取120 min，提取2 次，過濾收集濾液，用酸沉將濾液pH 調到5、4、3、2、1。減壓濃縮后用相同體積80%無水乙醇溶解，微孔濾膜過濾后按“1.3.2”方法測定并計算薔薇酸質量（設置3次重復）。

2）乙酸乙酯萃取次數單因素試驗。準確稱取3份刺梨果渣粉末，每份0.6 g，在單因素最優條件下提取。提取液抽濾，HCl 水溶液調pH 至2，用1 倍體積乙酸乙酯分別萃取1、2、3 次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮后稱重（設置3 次重復）。

3）乙酸乙酯萃取比例單因素試驗。準確稱取3份刺梨果渣粉末，每份0.6 g，在單因素最優條件下提取。提取液抽濾，HCl 水溶液調pH 至2，用0.5、1.0、1.5、2.0 倍體積乙酸乙酯分別萃取2 次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮后稱重（設置3 次重復）。

4）薔薇酸純化得率。純化后薔薇酸純化得率計算公式如下。

式中，m3為薔薇酸質量，g；m4為乙酸乙酯萃取質量，g。

2 結果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗結果

從單因素試驗結果（圖1 至圖5）可知，當液固比為15∶1（mL∶g）、提取時間120 min、提取溫度70 ℃、堿液pH 為12、提取2 次（綜合環保及得率考慮）時提取液中薔薇酸得率最高。

圖1 堿液pH 對薔薇酸得率的影響

圖2 液固比對薔薇酸得率的影響

圖3 提取溫度對薔薇酸得率的影響

圖4 提取次數對薔薇酸得率的影響

圖5 提取時間對薔薇酸得率的影響

2.2 響應面法優化試驗結果

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗 通過對試驗數據進行二次回歸分析，得出多項式回歸方程如下：Y=0.26+0.017A+0.035B+0.008 938C+0.006 050AB+0.008 025 AC+0.004 3BC-0.043A2-0.051B2-0.015C2，式 中Y 為薔薇酸得率，A、B、C 分別為提取溫度、堿液pH 和液固比。

響應面法試驗結果見表3，對此模型進行方差分析（表4），模型F 值是94.91，且P<0.01，表明建立的模型極顯著；失擬項P>0.05，回歸方程可代替實點對試驗結果進行分析，模型的決定系數R2=0.991 9，表明模型擬合度良好，可以準確預測薔薇酸得率，信噪比28.597>4，表明回歸方程可信度較高，該模型可用于理論預測優化刺梨果渣中薔薇酸的提取工藝。

模型的線性系數（A、B、C）、二次項系數（A2、B2、C2）和交互項（AC）的P<0.05，表明對薔薇酸得率有顯著影響。3 個因素對薔薇酸得率的影響大小次序為堿液pH>提取溫度>液固比。

2.2.2 響應面交互作用分析 響應值與各因素的等高線圖、三維空間響應面圖可直觀地展現各因素之間的交互作用對薔薇酸得率的影響，通過等高線的密集程度判斷兩因素交互的影響程度［21］。由圖6a可知，等高線沿堿液pH 密集，堿液pH 對薔薇酸得率的影響大于提取溫度的影響。由圖6b 可知，堿液pH 固定不變時，提高提取溫度，薔薇酸得率先增大后減小；提取溫度固定不變，堿液pH 增加，薔薇酸得率先增加后逐漸減小；由圖7a 可知，等高線沿提取溫度密集，提取溫度對薔薇酸得率的影響大于液固比；由圖7b 可知，提取溫度保持不變，增加液固比，薔薇酸得率基本保持不變，液固比保持不變，增加提取溫度，薔薇酸的得率先增大后減小；由圖8a 可知，等高線沿堿液pH 密集，堿液pH 對薔薇酸得率的影響大于液固比；由圖8b 可知，堿液pH 保持不變，增加液固比，薔薇酸得率基本保持不變，液固比保持不變，增加堿液pH，薔薇酸得率先增大后減小。綜上3個因素對薔薇酸得率影響為堿液pH>提取溫度>液固比。

表3 響應面法試驗結果

圖6 堿液pH 和提取溫度交互作用對薔薇酸得率的影響

表4 回歸模型方差分析

圖8 液固比和堿液pH 交互作用對薔薇酸得率的影響

2.2.3 提取工藝優化及驗證 通過Design expert 8.0 軟件中Numerical 優化模塊得到預測值，給出模型預測最佳提取條件為堿液pH 12.37、提取溫度72.55 ℃、液固比17.07（mL∶g），提取時間120 min，提取2 次；在此優化條件下薔薇酸得率為0.266%。因試驗儀器精度限制，采用堿液pH 12，提取溫度73 ℃，液固比17（mL∶g），提取時間120 min，提取2次的提取條件進行3 次平行試驗，測得薔薇酸的平均得率為0.257%，RSD 為1.403%，與預測值無顯著差異。

2.3 純化工藝研究

2.3.1 酸沉pH 的選擇 由高效液相色譜峰面積計算可得，酸沉pH 為5、4、3、2、1 時薔薇酸質量分別為（0.349±0.024）、（0.965±0.036）、（1.125±0.038）、（1.329±0.03）、（1.373±0.003）mg。pH 為2 和1 時薔薇酸質量相差不大，選用pH 為2 的酸沉條件。

2.3.2 乙酸乙酯萃取次數的選擇 用乙酸乙酯萃取的方法可以去掉大極性、水溶性雜質。 經計算后可得，乙酸乙酯萃取1、2、3 次的樣品乙酸乙酯層減壓濃縮后質量分別為（0.031 2±0.000 5）、（0.038 8±0.000 2）、（0.039 3±0.000 6）g。考慮節能環保的因素，選萃取2 次。

2.3.3 乙酸乙酯萃取比例的選擇 結果表明，乙酸乙酯萃取液體積比例為0.5、1.0、1.5、2.0 倍時樣品乙酸乙酯層減壓濃縮后質量分別為（0.035 9±0.000 8）、（0.038 3±0.000 6）、（0.038 8±0.000 4）、（0.039 0±0.000 7）g。考慮節能環保的因素，選萃取體積比例為1.0 倍體積。

3 結論

以薔薇酸得率為指標，采用單因素和響應面試驗優化了提取刺梨果渣粉末中薔薇酸的工藝條件，最佳試驗條件為堿液pH 12、提取溫度73 ℃、液固比17︰1（mL︰g），提取時間120 min，提取2 次；經酸沉pH 2、乙酸乙酯1.0 倍體積萃取2 次后薔薇酸的純化得率可達3.77%。區別于傳統的提取方法，采用堿提酸沉的提取方法，提取工藝簡便易行、成本低、幾乎零污染，且使用刺梨果渣作為提取對象，大大提高了刺梨的利用度，可為工業化提取分離薔薇酸提供參考依據。