“核磁共振法定量測定酚氨咖敏藥片中各組分”實驗的改進

陳文學，劉莎莎，李會香

復旦大學化學系，國家級化學實驗教學示范中心，上海 200433

核磁共振(NMR)技術(shù)自問世以來，因其具有樣品準備簡便、檢測快速、重復性好和對樣品無破壞性等優(yōu)勢一直深受化學、生物學和醫(yī)學等領(lǐng)域的專家青睞[1-4]。隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展(如計算機科學)，以及譜儀場強的不斷提高，核磁共振技術(shù)的應(yīng)用和方法研究更是日新月異，它不僅可同步實現(xiàn)定性鑒定和定量分析，而且其檢測靈敏度、準確度和精密度等逐漸接近或達到高效液相色譜(HPLC)的定量分析水平。因此，核磁共振檢測分析技術(shù)和方法已廣泛被引入到英國、美國和歐洲等國家藥典。

NMR技術(shù)有三個重要參數(shù)：化學位移、偶合常數(shù)和共振峰面積。其中化學位移、偶合常數(shù)是結(jié)構(gòu)測定的重要參數(shù)，共振峰面積則是定量分析的重要參數(shù)。利用 NMR方法進行定量分析的前提條件是：樣品中的每個組分中至少有一個或一組特征吸收峰不出現(xiàn)相互重疊；對于1H NMR來說，定量依據(jù)為：共振峰面積與產(chǎn)生該共振峰的質(zhì)子數(shù)成正比。

為讓學生了解NMR譜儀的工作原理并掌握基于NMR波譜技術(shù)對化合物(或藥物)進行定性和定量分析的基本方法，本實驗中心已為我校化學相關(guān)專業(yè)的大二本科生開設(shè)了“核磁共振法定量測定酚氨咖敏藥片中各組分”教學實驗[5]，其目的主要是服務(wù)于具有一定化學背景的化學系、材料系和高分子系等院系的本科學生，其實驗課程為“儀器分析和物理化學實驗A(上)”。迄今，該教學實驗已開設(shè)至少滿六個學期以上，且每次實驗均是單人單次進行和完成的(包括樣品制備、NMR上機操作和數(shù)據(jù)處理等)，每次實驗時間約3-4課時(半天)，學生以分組輪流形式每周均安排本教學實驗，每學期完成該實驗近200人次。

在該實驗中待測藥片的樣品處理需要水浴(約40 °C)加熱以增加組分的溶解度，而NMR譜儀測試時樣品溫度多為常溫(約22 °C)，那么在水浴溶解到冷卻至室溫進行1H NMR檢測時是否會有組分析出而影響檢測結(jié)果？鑒于此，我們擬對本實驗進行部分改進和探索：一是移去水浴加熱步驟，改用室溫直接溶解處理樣品。同時為保證藥片中各組分能充分溶解，選擇合適的藥片用量；二是隨著譜儀分辨率的提高，增加微量組分馬來酸氯苯那敏的含量測定。

1 實驗儀器和試劑

1.1 儀器

Bruker AVANCE NEO 400 MHz核磁共振譜儀(Bruker公司，德國)，精密電子天平(感量0.1 mg，Sartorius公司，德國)，離心機(微型，杭州米歐儀器公司，中國)，控溫儀(上海羌強儀器設(shè)備公司，中國)，移液槍(0.2 mL、1.0 mL，北京大龍興創(chuàng)實驗儀器公司，中國)，研缽，容量瓶(10.0 mL)，燒杯(10.0 mL)。

1.2 試劑和藥品

重水和 3-三甲基硅烷-1-丙磺酸鈉(CIL公司，英國)，氨基比林、對乙酰氨基酚、咖啡因和酚氨咖敏藥片均為上海上藥信誼藥廠出品。

2 實驗方法

2.1 實驗內(nèi)容

酚氨咖敏藥片，英文名：Paracetamol, Aminophenazone, Caffeine and Chlorpheniramine maleate tablet (PACC)。多為由對乙酰氨基酚組成的復方制劑，性狀為白色片。是主要用于醫(yī)治感冒、發(fā)熱、頭痛、神經(jīng)痛及風濕痛等癥的常見藥品。通常酚氨咖敏片包含的主要藥效成分為：氨基比林、對乙酰氨基酚、咖啡因和馬來酸氯苯那敏。

(1) 氨基比林(aminophenazone)。化學名為1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮，為白色或幾乎白色結(jié)晶性粉末。氨基比林主要起退熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用。

(2) 對乙酰氨基酚(paracetamol)。化學名為N-(4-羥基苯基)乙酰胺，為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。對乙酰氨基酚也主要起解熱和鎮(zhèn)痛作用。

(3) 咖啡因(caffeine)。別稱：1,3,7-三甲基黃嘌呤，為白色粉末或有光澤的針狀結(jié)晶。咖啡因?qū)僦袠猩窠?jīng)興奮藥，能起緩解頭痛作用。

(4) 馬來酸氯苯那敏(chlorpheniramine maleate)。化學名為 N,N-二甲基-γ-(4-氯苯基)-2-吡啶丙胺順丁烯二酸鹽，為白色結(jié)晶性粉末。馬來酸氯苯那敏可減輕因過敏引起的呼吸道癥狀，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有輕度抑制作用。

根據(jù)實驗教材[5]和文獻報道[6,7]，酚氨咖敏藥片中各組分的分子式、分子量和核磁共振氫譜中所對應(yīng)的主要特征信號峰(s)等信息總結(jié)在表1。

表1 酚氨咖敏藥片中各組分的核磁共振氫譜的主要特征信號峰

如用內(nèi)標法進行1H NMR波譜測定。可以選取3-三甲基硅烷-1-丙磺酸鈉(DSS鈉鹽，分子式：C6H15NaO3SSi；分子量為218.32)作為內(nèi)標物質(zhì)，并稱取一定量酚氨咖敏藥品(WS)和內(nèi)標物(WR)，再根據(jù)NMR法測定酚氨咖敏片中各主要組分的含量。

定量計算依據(jù)就是將樣品中某組分指定基團上的質(zhì)子引起的共振峰(即吸收峰)面積與由內(nèi)標物質(zhì)指定基團上的質(zhì)子引起的共振峰面積進行比較，便可算得樣品中該組分的含量，其計算公式如下：

其中，WX和MX分別為樣品中氨基比林、對乙酰氨基酚、咖啡因和馬來酸氯苯那敏等某組分的質(zhì)量(含量)和分子量；而WR和MR分別為內(nèi)標物的質(zhì)量和分子量；SX和SR分別為樣品和內(nèi)標物的特征峰面積，HX和HR則分別為樣品和內(nèi)標物的特征峰基團中相應(yīng)的質(zhì)子個數(shù)。

2.2 實驗步驟

2.2.1 混合標準樣品的配制和回收率測定

準確稱取氨基比林112 mg，對乙酰氨基酚104 mg，咖啡因34 mg，內(nèi)標物(3-三甲基硅烷-1-丙磺酸鈉) 68 mg，用重水溶解并定量轉(zhuǎn)移于10.0 mL容量瓶內(nèi)，用重水定容后備用。

取上述混合標準樣品溶液0.5 mL于NMR樣品管中，按照核磁共振譜儀使用步驟進行1H NMR譜測定。

2.2.2 樣品預處理和藥片各組分含量測定

取一片酚氨咖敏藥片(約500 mg)，在研缽中將藥片研成細粉狀。

準確稱取研細的藥片約20.0 mg (WS)，置于1.0 mL離心管，加入重水0.6 mL，再加入3-三甲基硅烷-1-丙磺酸鈉重水溶液(20.0 mg·mL?1) 0.1 mL。振蕩搖勻，然后在室溫直接離心分離，并取上層清液0.5 mL于NMR樣品管內(nèi)，同上測定其1H NMR譜。

分別準確稱取研細的藥片約20.0 mg和40.0 mg (WS)，置于1.0 mL離心管，加入重水0.6 mL，再加入3-三甲基硅烷-1-丙磺酸鈉重水溶液(20.0 mg·mL?1) 0.1 mL。振蕩搖勻后，于40 °C水浴加熱10 min左右，再離心分離(轉(zhuǎn)速4000 r·min?1，3 min)；最后取其上層清液0.5 mL于NMR樣品管內(nèi)，同上測定其1H NMR譜。

2.3 實驗改進

2.3.1 減小待測樣品用量，室溫測定藥片各組分含量

根據(jù)藥片中各組分在水中的溶解度情況(見表2)，在前期實驗[5]中，因藥片組分含量測定稱取的樣品量均為40.0 mg左右，那么采用水浴(40 °C)條件主要是為了增加和加速各組分的溶解，但在離心后冷卻至室溫進行1H NMR測定時，我們推測藥片中溶解度相對較小的對乙酰氨基酚組分可能有微量析出。因此，為提高檢測的準確度和精密度，本研究將適當減小待測樣品用量，并擬改在溫和(室溫約22 °C)條件下直接測定其藥片中各組分的含量，從而與40 °C水浴測定結(jié)果進行比較。

表2 酚氨咖敏片中各組分的含量和溶解情況

2.3.2 增加藥片中馬來酸氯苯那敏組分含量測定

酚氨咖敏藥片屬復方制劑，其藥品說明書上標明有四種藥效組分，先前實驗[5]因受核磁共振儀器分辨率(60 MHz)所限只測定了氨基比林、對乙酰氨基酚和咖啡因三種主要組分的含量，本文擬增加含量較小的馬來酸氯苯那敏(每片中約含2.0 mg，質(zhì)量分數(shù)約0.4%)組分的含量測定。

圖1是約40.0 mg酚氨咖敏藥片重水溶液的400 MHz核磁共振氫譜。如圖1所示，數(shù)字1是內(nèi)標物DSS的信號峰；數(shù)字2-8等信號峰(高場δ2.0-4.0)代表氨基比林、對乙酰氨基酚和咖啡因三組分中甲基的特征信號峰(單峰)；數(shù)字9是溶劑重水D2O的信號峰；數(shù)字10號共振峰(即左上放大8倍的NMR譜圖)則為微量組分馬來酸氯苯那敏中馬來酸的共軛雙鍵上的氫信號(單峰)。

圖1 酚氨咖敏藥片中各主要組分的400 MHz核磁共振氫譜

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 待測樣品減量和樣品處理條件對藥片各組分含量測定影響

根據(jù)實驗教材[5,8]和文獻報道[6,7]，首先依次稱取了約20 mg待測樣品18份，并分別在22 °C室溫和40 °C水浴(約10 min)條件下用1H NMR方法測定了酚氨咖敏藥片中各組分的含量。再依次稱取約40 mg待測樣品6份，只在40 °C水浴條件下測定其藥片中各組分的含量。經(jīng)多次重復實驗，所得的各組分含量見表3。

由表3可知，在待測樣品稱量均為20 mg時，水浴組(class 2)藥片中測定的各組分含量與室溫組(class 1)直接測定結(jié)果基本一致。同樣，如同為40 °C水浴條件時，與低稱量組(class 2)相比，高稱量組(class 3)藥片中測定的各組分含量也幾乎同比例增加。

表3 室溫22 °C和40 °C水浴時測定酚氨咖敏藥片中各組分含量(mg)

此外，上述三組樣品在室溫放置四天后再行1H NMR波譜測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每組樣品中各相同組分的含量幾乎沒有變化(數(shù)據(jù)未列出)，這說明待測樣品不僅非常穩(wěn)定，而且該檢測方法重現(xiàn)性很好。

3.2 樣品中各組分含量統(tǒng)計分析

為觀察水浴條件或藥片用量的減小對組分含量測定的影響，本文對上述實驗結(jié)果依次使用統(tǒng)計軟件(SPSS 17.0，美國SPSS公司)中獨立T檢驗方法進行了組間統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如圖2所示：不僅在Class 1和Class 2之間各組分的含量幾乎無顯著性差別(p＞ 0.05)，而且在Class 2和Class 3之間各組分的含量也幾乎無顯著性差別(p＞ 0.05)。這就是說，在當前溫和(22 °C室溫)條件下，該方法對藥片中各組分含量的測定與40 °C水浴條件測定結(jié)果是一致的；即使減少待測樣品用量，也同樣可實現(xiàn)對微量組分馬來酸氯苯那敏的準確測定。

圖2 室溫22 °C和40 °C水浴時測定三組樣品中各組分含量(mg)的均值、標準偏差和p值

4 結(jié)論

通過實驗改進和探索，我們發(fā)現(xiàn)待測樣品直接在室溫下溶解，或減少藥片的用量(保障藥片各組分在室溫下完全溶解)，均不會影響1H NMR方法定量測定酚氨咖敏藥片中氨基比林、對乙酰氨基酚和咖啡因等三組分含量。除此之外，隨著核磁共振譜儀場強的提高，檢測限降低，1H NMR方法還可定量測定酚氨咖敏藥片中微量的馬來酸氯苯那敏組分含量。

總之，1H NMR測定方法具有樣品處理簡單、用量少，對樣品無破壞性，檢測快速、重現(xiàn)性好，且無須分離等諸多優(yōu)勢。顯然，該方法不僅可同步實現(xiàn)酚氨咖敏藥片各組分含量測定，而且其測定速度、準確度和精密度等均接近或達到高效液相色譜的定量分析水平[9,10]。

也許，不久該方法測定酚氨咖敏藥片各組分含量還有望被錄入《中國藥典》。