IL-4 基因甲基化在支氣管哮喘患兒及健康兒童中的表達差異

馬澤南，顧利華

1.蘇州市吳中人民醫院兒科，江蘇蘇州 215128；2.蘇州市吳中人民醫院麻醉科，江蘇蘇州 215128

支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病[1]，它主要是通過多種細胞（例如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、T 淋巴細胞、以及氣道上皮細胞等等）與細胞組分參與的，此類慢性炎癥和氣道高反應性有密不可分的關系，可逆性呼氣氣流受限是出現頻率較高的表現癥狀，具有廣泛、多變性，一般在夜晚與早間發作，嚴重程度也會加劇，大部分患者能夠通過治療改善或者自行減輕。倘若沒有及時診治支氣管哮喘，隨著時間不斷發展，可能會出現氣道不可逆性縮窄與氣道重塑[2-3]。距現在的研究調查發現，它的主要病因與遺傳有關，群體患病率要低于哮喘患者的親屬，而且患病率和患病的嚴重程度隨著親緣關系越來越近，患病率也會越來越高，這兩者呈正比增長的趨勢[4]。該研究方便選取該院2016 年3 月—2019 年2 月收治的54 例支氣管哮喘患兒及54 名進行門診體檢的健康兒童為研究對象，用甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測IL-4 基因甲基化在支氣管哮喘患兒及健康兒童中表達差異展開分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

為研究IL-4 基因甲基化在支氣管哮喘患兒及健康兒童中的表達差異，方便選取該院收治的支氣管哮喘患兒54 例作為研究組，年齡5～12 歲，平均年齡為（7.0±1.5）歲；另選取同期該院進行門診體檢的健康兒童54名作為對照組，年齡6～11 歲，平均年齡為（7.0±1.2）歲。兩組兒童在年齡上差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。該研究經患兒及健康兒童的家屬知情同意。

1.2 診斷標準

進行確診時，要以中華醫學會呼吸分會規定的，關于支氣管哮喘的診斷標準為依據。支氣管哮喘具有以下臨床表現：①發作時伴有發作性咳嗽和胸悶癥狀，常常會出現呼氣性呼吸困難，夜間及凌晨發作和加重[5]。②干咳或咳大量白色泡沫痰，甚至出現發紺，哮喘癥狀發作的時間一般在數分鐘以內，在經過數小時到數天之后，可以通過支氣管舒張劑減輕癥狀，或者自行等待癥狀的緩解，在癥狀緩解數小時后，部分病患可能會再度發作。此外，在確診時，要一一排查，確保不是由于其他疾病造成的胸悶、氣急和咳嗽，最后就可以確診為支氣管哮喘。

1.3 測定3IL-4 基因甲基化的方法

1.3.1 提取1DNA 取研究組和對照組兒童的抗凝血各5 mL，用苯酚-氯仿法提取其中的DNA，在提取好DNA之后，對其含量與純度進行檢測，檢測工具選擇分光光度儀與瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 修飾2DNA 用亞硫酸氫鈉處理并純化經過提取得到的DNA，并放置-20℃的冰箱中，操作嚴謹，加入水（濃度為1%）100 mL，再加入6.8 μL 的NaOH（濃度為1 mol/L），搖勻，反應在50℃條件下進行15 min，然后加入558 μL 的修飾試劑Ⅰ混合，在50℃條件下反應5～14 h，再加入試劑Ⅲ并搖勻，在試管中的液體中放入試劑Ⅱ700 μL 以及試劑Ⅱ5 μL，并搖勻，在室溫下反應10 min，之后用5 000 r/min 的離心速度離心10 s，直到形成沉淀，并去掉上清液，再加入1 mL 的乙醇（70%）震蕩，用之前的離心速度離心8 s，也去掉上清液，重復操作3 次后再用之前的離心速度離心2 min，去掉上清液，完成對DNA 的修飾。

1.3.3 檢測甲基化的方法 經過亞硫酸鈉對基因組DNA 的修飾，依照甲基化與非甲基化序列的引物進行設計，采取PCR 擴增。

1.3.4 PCR 擴增方法 被修飾后的DNA1.8 μL 1.8×PCR 9.8 μL，甲基化上游引物1.1 μL，甲基化下游產物1.1 μL，滅菌雙蒸水6.2 μL，總共20 μL。IL-4 引物擴增條件；95℃預變性6 min，再變性20 s，50℃退火20 s，70℃延伸20 s，循環25 次，70℃再延伸50 s。把擴增產物放于4℃條件下，利用紫外凝膠成像系統，對圖像分析的結論進行掃描與采集。

1.4 判定5MSP

倘若有290 bp 擴增條帶在IL-4 基因甲基化引物中出現，認為甲基化存在，若291 bp 擴增條帶在非甲基化引物中出現，則認為非甲基化存在。

1.5 統計方法

數據選用SPSS 21.0 統計學軟件進行分析。計數資料以[n(%)]表示，組間差異比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSP 的結果

在進行MSP 檢測過程中，甲基化引物有290 bp 擴增條帶產生，非甲基化引物則有291 bp 擴增條帶產生，可以在IL-4 基因甲基化電泳圖譜中清楚地觀察到。

2.2 比較研究組與對照組的甲基化率

研究組的IL-4 基因完全甲基化率為31.48%（17/54），未甲基化率為18.52%（10/54），甲基化與未甲基化的共存率為50%（27/54），對照組的IL-4 基因完全甲基化率為14.81%（8/54），未甲基化率為44.44%（24/54），甲基化與未甲基化的共存率為40.74%（22/54），研究組的甲基化率與對照組的甲基化率差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患兒IL-4 基因甲基化率比較[n（%）]

3 討論

支氣管哮喘病發生的因素除了遺傳因素之外，還有一些變應原的因素導致小兒發生支氣管哮喘。最常見并且危害最大的室內變應原是塵螨，是世界范圍內哮喘發病的重要原因[6]，而最普遍的導致哮喘發作的室外變應原是花粉和草粉，還有其他各種特異以及非特異性吸入物，比如：二氧化硫、動物毛屑和氨氣等。而谷物粉、茶、咖啡豆、家蠶、鴿子、蘑菇、抗生素、活性染料、乙二胺等屬于常見的職業性變應原[7-8]，此外藥物導致哮喘的變應原則是普萘洛爾（心得安）、阿司匹林與部分非皮質激素類抗炎藥[9]，除此之外，誘發哮喘的因素也包含蝦、魚、蛋類和牛奶等食物。除了以上這些，日常生活中存在的空氣污染、吸煙產生的氣體，還有氣候的變化，或者劇烈運動吸入冷空氣，具有感染性的細菌、原蟲、病毒以及寄生蟲等，這些因素都是引發哮喘發作的原因。

兒童患有支氣管哮喘，會升高IL-4 基因甲基化，由此可以發現IL-4 基因甲基化對IL-4 的分泌有促進作用，對IgE 的合成有重要影響，IL-4 基因在靜息CD4+中，處于非甲基化，IL-4 甲基化與過敏原接觸過后，IL-4啟動區甲基化程度升高，使得產生大量IL-4，引起支氣管哮喘的發生[5，9-10]。

小兒哮喘發作與呼吸道感染有緊密的聯系，特別是病毒和支原體感染。絕大部分嬰幼兒哮喘，是呼吸道感染造成的，呼吸道病毒是其主要的病原體，研究證實，喘息是由于合胞病毒感染可因發生特異性免疫球蛋白IgE 介導I 型變態反應而產生的。成人對塵螨的過敏比兒童期要少，塵螨存活的最短適宜季節是春秋季節，所以春秋季節是塵螨性哮喘發作的高峰期，患者多于夜間發作。兒童對外界氣候的變化是非常敏感的，比如驟然變冷的氣溫或者氣壓的降低，往往都會導致哮喘發作，所以，兒童在春秋兩個季節發病率明顯較高。也有研究表明哮喘兒童也常受情緒影響，在情緒激動時或其他心理活動障礙時常伴有迷走神經興奮而引起哮喘發作。

對于兒童哮喘病的治療，應遵照持續性、規范性、長期性與個體化治療的原則，處于急性發作期階段，應該迅速對癥狀采取緩解措施、進行抗炎治療、平喘、祛痰、鎮靜、抗過敏。防止與致敏原進行接觸。選用抗生素，在慢性持續期時應防止癥狀加重，防止氣道重塑，加強身體鍛煉、合理調節室溫、提高自我管理水平、采取藥物和非藥物結合治療，多功能治療防護措施要做好，此外哮喘防治教育、及時處理患兒心理問題、回避變應原、提高生命質量、藥物經濟學等非藥物治療，對長期管理哮喘能夠起到關鍵作用，不能過分忽視。

研究組的IL-4 基因甲基化率與對照組比較，研究組中的支氣管哮喘患兒的IL-4 基因完全甲基化率為44.44%（24/54），未甲基化率為18.52%（10/54），甲基化與未甲基化的共存率為50%（27/54），對照組的IL-4 基因完全甲基化率為14.81%（8/54），未甲基化率為37.04%（20/54），甲基化與未甲基化的共存率為40.74%（22/54），甲基化率差異有統計學意義（P＜0.05），與韓繼紅等人[11]的研究結果相一致：研究組IL-4 基因完全甲基化率為42.5%(34/80)，未甲基化率為25.0%(20/80)，甲基化和未甲基化共存率為32.5%(26/80)；對照組IL-4基因啟動子區完全甲基化率為11.3%（9/80），未甲基化率為46.3%（37/80）；甲基化和未甲基化共存率為42.5%（34/8），重度發病期患兒的IL-4 表達水平明顯高于輕度發病期和緩解期。

綜上所述，IL-4 甲基化的表達的差異對支氣管哮喘的患兒有著一定的影響。