乙烯利對干旱條件下多年生黑麥草生理指標(biāo)的影響

段夢琪， 彭 春， 張 睿， 高婭楠， 李麗菁， 張智韋， 許立新*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京100083；2.河北水利電力學(xué)院，河北 滄州061000)

干旱是影響草坪草生長和草坪質(zhì)量的主要因素之一[1]。有研究表明，在干旱條件下使用植物生長調(diào)節(jié)劑可提高植物耐旱性，乙烯利是一種重要的植物生長調(diào)節(jié)劑，在作物中可用于提高植物耐旱性[2]。乙烯利可滲入植物組織，進(jìn)一步分解轉(zhuǎn)運(yùn)為乙烯，作用于器官，從而起到調(diào)節(jié)作用[3]。乙烯介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可改善逆境條件下的植物生長性能和發(fā)育狀況[4-5]，韓露[6]、隋永超等[7]研究發(fā)現(xiàn)，葉片噴施乙烯利能夠緩解干旱對草地早熟禾(PoapratensisL.)的脅迫程度，并且能夠促進(jìn)干旱脅迫后的復(fù)水恢復(fù)。堯金燕[8]、莫萍麗[9]的研究表明葉片噴施乙烯利對提高甘蔗(Saccharumofficinarum)對缺水的適應(yīng)性具有積極作用，起到保護(hù)細(xì)胞膜、維持正常的滲透調(diào)節(jié)功能、降低蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度、提高保護(hù)酶活性的作用，并通過促進(jìn)分蘗抑制增高來適應(yīng)干旱缺水情況。閆秋潔等[10]的研究發(fā)現(xiàn)乙烯利浸種能顯著緩解玉米(ZeamaysL.)的干旱脅迫程度，提高玉米種子的發(fā)芽率和幼苗高度，同時(shí)降低丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，增強(qiáng)過氧化物酶(Guaiacol peroxidase，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性。蘇黎等[11]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的乙烯利浸種可提高不同土壤水分條件下多年生黑麥草(LoliumperenneL.)的抗旱性，但葉片噴施乙烯利是否有和浸種處理同樣的作用未有進(jìn)一步研究。

多年生黑麥草由于其生長分蘗快、外形美觀、綠色期長和耐牧性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國乃至全世界草坪建植和飼草栽培中最受歡迎的草種之一[1]。然而與其他禾本科草相比，多年生黑麥草耐旱能力相對較弱，限制了該草進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用[12]。為了測試葉片噴施乙烯利對多年生黑麥草耐旱性的影響并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)理，本研究選取4種多年生黑麥草為植物材料，在葉片噴施乙烯利后進(jìn)行干旱處理，測定耐旱性相關(guān)生理指標(biāo)，分析噴施乙烯利后多年生黑麥草干旱脅迫下生理指標(biāo)的變化，以期了解干旱條件下乙烯利對多年生黑麥草的影響，為后續(xù)揭示乙烯利提升草坪草耐旱性機(jī)理提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為草坪草管理實(shí)踐中乙烯利的可能應(yīng)用途徑提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)選用多年生黑麥草的4個(gè)品種為研究材料，分別是‘Neruda’，‘Accent’，‘MS’，‘AST’?！甆eruda’，‘Accent’種子于2017年購于北京正道生態(tài)科技有限公司，‘MS’，‘AST’種子于北京林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，均存于4℃避光條件下，種子凈度為98%、發(fā)芽率‘Neruda’，‘Accent’為70%，‘MS’和‘AST’為90%。于2018年6月1日進(jìn)行播種，土培直播種植，植株生長于光照培養(yǎng)箱中，定期澆等量的水，保證水分供應(yīng)，每月澆灌1次等量的霍格蘭特營養(yǎng)液。試驗(yàn)于幼苗期進(jìn)行，2018年8月16日噴施乙烯利，經(jīng)本課題組工作人員前期試驗(yàn)得出噴施乙烯利方法[13]，濃度為200 mg·L-1，噴至葉片凝結(jié)水珠為止，對照組噴施純凈水，每組處理5個(gè)重復(fù)。葉片噴施處理1天后，停止?jié)菜_始進(jìn)行干旱處理，試驗(yàn)分別在8月17日、8月22日、8月27日進(jìn)行葉片取樣，取樣時(shí)間對應(yīng)土壤含水量分別為30.0～33.5%，8.0%～10.0%，1.0%～2.0%，8月27日取樣后進(jìn)行充分澆水，使土壤含水量恢復(fù)至30.0～32.5%，8月29日進(jìn)行最后一次葉片取樣。

1.2 測定指標(biāo)及方法

土壤含水量(Soil volumetric water content，SWC)使用TDR(Time domain reflecto-metry)儀器采用時(shí)間域反射方法[14]進(jìn)行測定，本研究采用10 cm波導(dǎo)探針探測表層土壤水分含量。葉片相對含水量(Relative water content，RWC)采用烘干法[15]進(jìn)行測定。電解質(zhì)滲透率(Electrolytic leakage，EL)的測定采用采用Blum和Ebercon[16]的方法。脯氨酸(Proline，Pro)采用酸性茚三酮比色法[13]進(jìn)行測定。CAT活性采用紫外吸收法[17]進(jìn)行測定。POD活性采用愈創(chuàng)木酌法[18]進(jìn)行測定?？箟难徇^氧化氫酶(Ascorbate peroxidase，APX)活性釆用Nakano和Asada[19]的方法進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中結(jié)果均采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和一般線性模型單變量分析，并用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤來表示數(shù)據(jù)結(jié)果，使用WPS辦公軟件中的Excel制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利對多年生黑麥草干旱條件下葉片相對含水量的影響

水分充足時(shí)，乙烯利處理組與對照組(干旱組)的各品種葉片相對含水量均無顯著差異(圖1)。干旱處理(停止?jié)菜?10 d后，經(jīng)乙烯利處理的‘Neruda’，‘MS’和‘AST’3個(gè)品種的RWC顯著高于各自未經(jīng)乙烯利處理的對照組(P<0.05)。干旱處理10 d時(shí)，各個(gè)品種對照組和乙烯利處理組的RWC分別是：‘Neruda’為27.64% 和38.14%，‘MS’為26.04%和36.02%，‘AST’為47.40%和59.16%?！瓵ccent’在干旱條件下經(jīng)乙烯利處理10 d后RWC平均值高于對照組但不顯著，分別為23.40%和28.68%?？梢钥闯?，在相同程度的干旱處理(10 d不澆水)下，‘AST’品種的RWC最高，‘Neruda’和‘MS’居中，而‘Accent’與這幾個(gè)品種相比RWC最低。

復(fù)水恢復(fù)2 d后，各品種的RWC都得到一定程度的恢復(fù)，但不能恢復(fù)到干旱處理前水平。乙烯利處理對于‘Neruda’，‘Accent’和‘AST’3個(gè)品種的復(fù)水恢復(fù)能力沒有影響，但提高了‘MS’的復(fù)水恢復(fù)能力(圖1 c)，‘MS’復(fù)水恢復(fù)2天后對照組和乙烯利處理組的RWC分別為55.10 %和69.48 %。

圖1 乙烯利處理對干旱條件下多年生黑麥草葉片相對含水量的影響

2.2 乙烯利對多年生黑麥草干旱條件下電解質(zhì)滲透率的影響

隨著干旱處理時(shí)間的延長，多年生黑麥草電解質(zhì)滲透率顯著上升(圖2)，復(fù)水恢復(fù)處理2 d后，電解質(zhì)滲透率降低。在沒有水分脅迫以及輕微水分脅迫下(干旱處理5 d時(shí))，乙烯利處理不影響多年生黑麥草的電解質(zhì)滲透率(圖2a，b，c)。‘Accent’未處理前電解質(zhì)滲透率對照組和乙烯利處理組分別為14.17%和15.09%，絕對數(shù)值相近；由于品種差異，乙烯利處理對‘AST’的電解質(zhì)滲透率抑制作用在干旱處理5 d時(shí)開始出現(xiàn)。當(dāng)干旱處理10 d時(shí)，乙烯利處理顯著降低各品種的電解質(zhì)滲透率(P<0.05)，各品種的電解質(zhì)滲透率分別是：‘Neruda’為47.15%和30.64%，‘Accent’為46.19% 和37.59%，‘MS’為52.62%和32.78%，‘AST’為58.68%和38.86%。復(fù)水2 d后，乙烯利處理組和對照組的電解質(zhì)滲透率均明顯下降，并且恢復(fù)到到處理前水平。

圖2 乙烯利處理對干旱條件下多年生黑麥草電解質(zhì)滲透率的影響

2.3 乙烯利處理對多年生黑麥草干旱條件下脯氨酸含量的影響

水分充足及干旱處理5 d時(shí)，各品種葉片脯氨酸含量差異不顯著(圖3)，對照組和乙烯利處理組差異也不顯著。干旱處理10 d后，除了‘AST’品種，經(jīng)乙烯利處理的其它品種相對于各自未經(jīng)乙烯利處理的對照組脯氨酸含量均顯著降低(P<0.05)，脯氨酸含量分別是：‘Neruda’為992.51 Ug·g-1和376.17 Ug·g-1，‘Accent’為1 188.33 Ug·g-1和851.36 Ug·g-1，‘MS’為12 697.77 Ug·g-1和6 262.81 Ug·g-1。品種‘AST’的乙烯利處理組和對照組差異不顯著，為4 935.39 Ug·g-1和5 471.60 Ug·g-1。

復(fù)水恢復(fù)2 d后，脯氨酸含量均下降，但除‘MS’外其它品種都顯著高于干旱處理前水平(P<0.05)(圖3a，b，d)。乙烯利處理促進(jìn)了‘Neruda’品種在復(fù)水恢復(fù)階段下，脯氨酸含量的進(jìn)一步下降，分別是161.96 Ug·g-1和108.36 Ug·g-1?！瓵ccent’，‘MS’和‘AST’3個(gè)品種的乙烯利處理組和對照組在復(fù)水恢復(fù)2 d時(shí)，脯氨酸含量差異不顯著。

圖3 乙烯利處理對干旱條件下多年生黑麥草脯氨酸含量的影響

綜合以上結(jié)果可以看出：干旱條件下，乙烯利處理能夠?qū)Ρ狙芯繙y試中干旱條件下的4個(gè)耐旱性不同品種的葉片相對含水量、電解質(zhì)滲透率以及脯氨酸含量有不同程度的提升和緩解作用，說明本研究中濃度的乙烯利處理能夠不同程度提升多年生黑麥草的耐旱性，而干旱處理5 d的結(jié)果沒有干旱處理10 d結(jié)果顯著。復(fù)水情況下乙烯利處理組和對照組數(shù)據(jù)差異不顯著，僅有‘MS’的葉片相對含水量和‘Neruda’的脯氨酸含量因品種特異性原因差異顯著。

2.4 乙烯利處理對多年生黑麥草干旱條件下抗氧化酶活性的影響

為了進(jìn)一步探究乙烯利提升多年生黑麥草耐旱性的機(jī)理，本研究挑選了耐旱性有差異的2個(gè)品種‘AST’和‘MS’進(jìn)行抗氧化酶活性測試，研究干旱處理10 d和未經(jīng)干旱處理?xiàng)l件下，多年生黑麥草抗氧化酶的變化和對乙烯利處理的響應(yīng)。

2.4.1乙烯利處理對多年生黑麥草干旱條件下POD活性的影響 當(dāng)水分充足時(shí)，乙烯利處理組和對照組的POD活性差異不顯著(圖4)。干旱處理10 d后，各品種的POD活性降低，乙烯利處理組的POD活性顯著高于對照組(P<0.05)，與干旱處理前保持同一水平，‘MS’對照組和乙烯利處理組的POD活性分別為1 696.67 U·g-1·min-1和4 354.58 U·g-1·min-1，‘AST’對照組和乙烯利處理組的POD活性分別為2 441.25 U·g-1·min-1和7 833.33 U·g-1·min-1。由此可知，葉片噴施乙烯利處理可以大幅提高干旱環(huán)境下多年生黑麥草POD活性。

圖4 乙烯利處理對干旱條件下多年生黑麥草POD活性的影響

2.4.2乙烯利處理對多年生黑麥草干旱條件下CAT活性的影響 當(dāng)水分充足時(shí)，乙烯利處理組和對照組的CAT活性差異不顯著(圖5)。經(jīng)干旱處理10 d后，乙烯利處理組和對照組相比，品種‘MS’的CAT活性差異不顯著，對照組和乙烯利處理組CAT活性分別為673.67 U·g-1·min-1和556.08 U·g-1·min-1；‘AST’的乙烯利處理組CAT活性顯著提高(P<0.05)，對照組和乙烯利處理組CAT活性分別為183.00 U·g-1·min-1和595.08 U·g-1·min-1。

圖5 乙烯利處理對干旱條件下多年生黑麥草CAT活性的影響

2.4.3乙烯利處理對多年生黑麥草干旱條件下APX活性的影響 沒有水分脅迫時(shí)(干旱處理0 d)，乙烯利導(dǎo)致‘MS’品種的APX活性下降，對于‘AST’品種沒有影響(圖6)。干旱處理10 d，‘MS’的乙烯利處理組和對照組相比，APX活性差異不顯著，‘AST’經(jīng)乙烯利處理后較干旱前APX活性顯著下降(P<0.05)。

圖6 乙烯利處理對干旱條件下多年生黑麥草APX活性的影響

3 討論

3.1 乙烯利對葉片相對含水量的影響

葉片相對含水量能夠直接反映土壤水分對植物作用的有效性，是評估葉片內(nèi)部水分變化的指標(biāo)[20]。葉片相對含水量可以用作衡量植物內(nèi)部水分缺失情況和持水能力的指標(biāo)，是干旱條件下植物耐旱性指標(biāo)之一[21-23]?？ǖ聽柊⒉级紵嵛魈岬难芯縖24]也顯示，葉片含水量隨植物受干旱脅迫的增強(qiáng)而降低，在干旱脅迫下，抗旱性越強(qiáng)的植物葉片相對含水量下降越緩慢，葉片持水能力越強(qiáng)，細(xì)胞膜系統(tǒng)所受的傷害越小。

本研究表明，葉片噴施乙烯利處理可以不同程度提高干旱條件下多年生黑麥草(‘Neruda’，‘MS’，‘AST’)的葉片相對含水量(圖1a，c，d)，也可以提高‘MS’品種RWC的復(fù)水恢復(fù)能力(圖1c)，然而對于品種‘Accent’的RWC在干旱條件下有提升作用但不顯著。干旱條件下，不同品種的RWC對于乙烯響應(yīng)敏感性不同，使得乙烯利對多年生黑麥草干旱條件下RWC的提升作用存在品種差異。乙烯利處理后這4個(gè)品種耐旱性比較結(jié)果為，‘AST’的耐旱性最強(qiáng)，‘Neruda’和‘MS’次之，‘Accent’的耐旱性最差。從總體趨勢來說，葉片噴施乙烯利可以減緩干旱脅迫下多年生黑麥草葉片相對含水量的下降，說明噴施乙烯利能夠提高多年生黑麥草在干旱脅迫下的持水能力，改善植物體內(nèi)的水分狀況，從而增強(qiáng)多年生黑麥草的抗旱性。

3.2 乙烯利對電解質(zhì)滲透率的影響

電解質(zhì)滲透率是能夠反映植物細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，電解質(zhì)滲透率越大說明膜透性越大，植物受損傷越嚴(yán)重，反之同理[25]。Saneokaetal[26]指出，水分脅迫會導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷或破壞，使膜的選擇透性功能減弱或喪失、透性增大、電解質(zhì)外滲加劇。Paula等[27]指出維持細(xì)胞膜的完整性、穩(wěn)定性以及流動性對植物應(yīng)對干旱、脫水脅迫尤為重要。而堯金燕[8]的試驗(yàn)結(jié)果表明，干旱脅迫下乙烯利處理能降低甘蔗的電解質(zhì)外滲率，提高甘蔗在水分虧缺條件下生長狀況的表現(xiàn)。

本研究結(jié)果同樣表明，干旱條件下4種多年生黑麥草的電解質(zhì)滲透率上升，噴施乙烯利可以減緩在同等干旱條件下電解質(zhì)滲透率的上升水平，在干旱程度加強(qiáng)的情況下表現(xiàn)尤為顯著，‘Neruda’、‘Accent’、‘MS’和‘AST’4個(gè)品種反應(yīng)了相同的結(jié)果(圖2)。復(fù)水2 d后，4個(gè)品種對照組的電解質(zhì)滲透率指標(biāo)已恢復(fù)到正常水平，所以乙烯利處理組沒有明顯效果。由此可知，葉片噴施乙烯利處理可以降低干旱環(huán)境下多年生黑麥草的電解質(zhì)滲透率，但對于電解質(zhì)滲透率的復(fù)水恢復(fù)能力的提高沒有明顯作用。噴施乙烯利可減輕重度干旱條件下細(xì)胞膜受傷害的程度，增強(qiáng)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，因而提高了多年生黑麥草的耐旱性。

3.3 乙烯利對游離脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物在脅迫中最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它的作用主要包括滲透調(diào)節(jié)、保護(hù)生物大分子、參與氮代謝和能量代謝等[28]，在逆境脅迫下植物體內(nèi)脯氨酸會大量積累。許多研究證實(shí)植物體內(nèi)積累脯氨酸可以提高非生物脅迫的耐受性。朱維琴等[29]的研究表明，植物遭受水分脅迫后，脯氨酸會產(chǎn)生積累，這是植物響應(yīng)干旱脅迫作出的重要生理反應(yīng)。揭雨成等[30]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，苧麻在受到水分脅迫較輕的情況時(shí)，脯氨酸在抗旱性弱的品種中積累的水平反而更高，而之后隨著脅迫程度的加深，游離脯氨酸在抗旱性強(qiáng)的品種中積累的水平更高，經(jīng)過復(fù)水處理后，游離脯氨酸的含量在抗旱性強(qiáng)的品種中下降的速度更快。吳情[31]的試驗(yàn)結(jié)果也顯示，多年生黑麥草受水分脅迫初期的植物應(yīng)答脅迫反應(yīng)使脯氨酸在植物體內(nèi)積累，這種積累也可能是由于植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能在受損傷后的表現(xiàn)，也是種傷害反應(yīng)指標(biāo)。

在本研究中，干旱處理10 d時(shí)葉片噴施乙烯利處理可以抑制干旱環(huán)境下多年生黑麥草‘Neruda’，‘Accent’和‘MS’3個(gè)品種的脯氨酸合成；對于‘AST’品種的脯氨酸含量抑制作用不顯著，可能由于‘AST’耐旱性較強(qiáng)，干旱處理10 d沒有全面觸發(fā)‘AST’品種的脯氨酸代謝和乙烯交叉響應(yīng)機(jī)制。復(fù)水2 d后，只有‘MS’品種的脯氨酸含量降低到處理前水平，其他品種脯氨酸含量未降低到處理前水平，說明‘MS’的復(fù)水恢復(fù)能力較強(qiáng)。‘Neruda’品種經(jīng)乙烯利處理后脯氨酸含量顯著低于對照組(P<0.05)，可能是因?yàn)樵撈贩N抗旱能力較弱，對乙烯利響應(yīng)敏感所至。未來有待進(jìn)一步研究更長時(shí)間干旱處理下，乙烯利對此品種脯氨酸含量的影響。噴施乙烯利改善了多年生黑麥草體內(nèi)含水量(RWC)，減輕了干旱對細(xì)胞膜的傷害，調(diào)節(jié)了植物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，緩解了植物受干旱脅迫的程度，脯氨酸作為傷害指示指標(biāo)，在干旱條件下，噴施乙烯利后含量較對照組顯著下降，說明乙烯利緩解了干旱條件下多年生黑麥草的細(xì)胞損傷。

3.4 乙烯利對抗氧化酶活性的影響

干旱等環(huán)境脅迫誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量的活性氧基團(tuán)或分子(ROS)破壞植物細(xì)胞，這些活性氧基團(tuán)或分子包括單線態(tài)氧(1O2)，超氧化物(O2-)，過氧化氫(H2O2)，和羥基自由基(-OH)[32-34]。這些ROS能夠與脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)相互作用，引起細(xì)胞損傷[35]。許多植物物種已具備完善的抗氧化防御系統(tǒng)，以保護(hù)細(xì)胞免受由逆境誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子的傷害，提高抗氧化相關(guān)的酶的活性就是其中的一項(xiàng)防御機(jī)制，這些酶包括超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)，過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)[36-37]等。許立新等[23]指出，在抗氧化酶系統(tǒng)中SOD與CAT共同作用可以將有害的H2O2和O2-轉(zhuǎn)化成無害的H2O和O2；CAT和APX對于清除H2O2也起到了重要的作用；POD則能催化依靠H2O2參與的底物氧化反應(yīng)。本研究中，在土壤重度干旱時(shí)，品種‘MS’和‘AST’的乙烯利處理組POD活性顯著高于對照組，這說明乙烯利處理能夠增加干旱條件下POD活性，從而有效清除過多的過氧化氫，阻止過氧化物對細(xì)胞膜的傷害，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。干旱條件下，乙烯利處理對多年生黑麥草APX和CAT的活性變化影響不明顯。因此，干旱脅迫下，POD可能是多年生黑麥草響應(yīng)乙烯利處理的抗氧化酶系統(tǒng)的主效因子，清除大量活性氧基團(tuán)或分子,從而提升多年生黑麥草的耐旱性。

4 結(jié)論

葉片噴施乙烯利可以提升多年生黑麥草的耐旱性，但對不同品種、不同材料的作用幅度和方式不同，表現(xiàn)為生理指標(biāo)的響應(yīng)和變化規(guī)律不同。例如在干旱處理10 d時(shí)，乙烯利處理顯著提高了‘Neruda’、‘MS’和‘AST’3個(gè)品種的葉片相對含水量，而‘Accent’的葉片相對含水量平均提高了22.56%，但差異不顯著。此外，乙烯利促進(jìn)‘MS’和‘AST’干旱脅迫下的POD酶活性的提升，但僅有‘AST’的CAT酶活性大幅提升(225.18%)。不同材料對乙烯利處理響應(yīng)的差異性解釋機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究?？傮w來看，乙烯利提高了干旱脅迫下多年生黑麥草的葉片持水能力，緩解了干旱脅迫誘導(dǎo)的膜受損程度，提升了抗氧化能力，但在實(shí)踐應(yīng)用中需注意用量方法并考慮品種差異性。