不同乳酸菌組合對苜蓿青貯細菌群落結構的影響

王麗學， 韓 靜， 陳龍賓， 余新越， 劉景喜， 馬 毅*， 霍文娟

(1. 天津市農業科學院信息研究所， 天津 300192； 2. 天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室， 天津300384； 3. 天津市農業科學院畜牧獸醫研究所， 天津 300381； 4. 天津師范大學地理與環境科學學院， 天津 300387；5. 天津市農業科學院農產品保鮮與加工技術研究所， 天津 300381)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，為世界上廣泛種植的優質蛋白類牧草，被譽為牧草之王[1]。為避免雨季苜蓿收貯過程中的損失，通常制作青貯以減少養分流失，便于長期保存[2]。優質苜蓿青貯具有柔軟多汁、適口性好、消化率高等優點，但因苜蓿水溶性碳水化合物低且緩沖能值高，在青貯過程中較難形成低pH值狀態，極易發生梭菌等有害菌發酵，進而降低其青貯品質[3]。因此，在苜蓿青貯過程中通常需要添加青貯添加劑[2,4]。青貯添加劑按其作用效果可分為發酵促進劑、發酵抑制劑和營養性添加劑[5]。乳酸菌屬于發酵促進劑[3]，可促進乳酸發酵、抑制雜菌生長、減少養分損失同時提升青貯發酵品質[6]。目前已發現的乳酸菌主要包括細菌界5門43屬[7]，其中青貯添加劑常用的有乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)等[8-12]，因乳酸菌特征不同，在實際應用中常搭配使用。

青貯是一個復雜的微生物菌群如乳酸菌、腐敗菌、酵母菌、霉菌、芽孢桿菌等的活動過程[13]，微生物群落組成可直接影響青貯品質[14]，甚至進一步影響反芻動物瘤胃微生物群系[15-16]。研究表明，青貯微生物群落與青貯物料自身特征[17-20]、外源添加物質[21-22]或添加劑[23-24]、青貯方式[25]及青貯物料所生長的土壤環境[26]等多種因素有關。不同微生物添加劑對苜蓿青貯細菌群落結構影響不同，有研究表明，接種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的苜蓿青貯由植物乳桿菌主導整個發酵過程[24,27]；接種產纖維素酶的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)后，苜蓿青貯腸球菌屬(Enterococcus)豐度增加，而當短小芽孢桿菌與植物乳桿菌混合應用時，苜蓿青貯腸球菌屬豐度降低而乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)豐度增加[27]；大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7)與植物乳桿菌或布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)的組合處理降低了苜蓿青貯Shannon多樣性指數，且大腸桿菌與布氏乳桿菌的組合還降低了厚壁菌門(Firmicutes)豐度但增加了變形菌門(Proteobacteria)豐度[28]。由此可見，不同微生物添加劑對苜蓿青貯細菌群落結構的影響存在互作效應，揭示這種互作效應對于苜蓿青貯添加劑開發具有重要意義。

鑒于此，本研究在對5種乳酸菌對苜蓿青貯營養和發酵品質影響[29]研究的基礎上，運用高通量測序技術分析了6種不同乳酸菌組合苜蓿青貯細菌群落結構差異，揭示其對苜蓿青貯營養和發酵品質影響的作用機理，為后續相關乳酸菌在苜蓿青貯中的進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用苜蓿為丹農種子公司提供的‘北極熊’品種，種植于天津市農業資源與環境研究所的濱海鹽堿地綠化土壤改良科研試驗基地。

試驗用乳酸菌：2種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，菌種保藏號分別為ACCC11016(記為L1)和CICC20765(記為L2)；乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici，記為P1)，菌種保藏號為CGMCC 1.4，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，記為P2)，菌種保藏號為CICC 22737；凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans，記為B)，菌種保藏號為ACCC10229。其中植物乳桿菌CICC20765和戊糖片球菌購于中國工業微生物菌種保藏管理中心，其他菌種均由天津市農業科學院畜牧獸醫研究所保藏。

1.2 試驗設計

試驗于2017年5月開展，設置6個菌種組合處理，分別為L1P1，L1P2，L2P1，L2P2，P1B，P2B。將菌種L1，L2，P1，P2，B分別活化后培養于MRS液體培養基中，稀釋或濃縮至菌落總數1.0×109CFU·mL-1；刈割后的苜蓿晾曬24 h，其干物質含量為(29.03±0.79)%，切割成2～5 cm的小段，分別按1.5 mL·kg-1的劑量添加等比例混合的乳酸菌組合，以等量蒸餾水替代乳酸菌組合作為對照組(CK)，為確保添加劑與苜蓿均勻混合，將添加物稀釋4倍后均勻噴灑在切割好的苜蓿上，裝入特制聚乙烯塑料袋(25 cm×35 cm)，每袋300 g，每個處理3個重復，用真空封口機同時進行抽氣和封口。室溫避光保存45 d后，在每個樣品的非表層部分用經高溫滅菌的鑷子按照五點采樣法采集苜蓿青貯樣品20 g左右，先液氮速凍，再存于-80℃冰箱中，用于細菌群落結構測定與分析。

1.3 細菌群落結構測定與分析

苜蓿青貯樣品細菌群落結構測定由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。采用Illumina MiSeq平臺選用長度約為280 bp的細菌16S rRNA基因的高度可變的V3-V4區進行測序分析，其PCR擴增引物為338F(5′-3′)ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R(5′-3′)GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR反應體系(25 μL)：Q5高保真DNA聚合酶0.25 μL，5×反應緩沖液5 μL，5×高GC緩沖液5 μL，10 mMdNTP0.5 μL，模板DNA1 μL，正向引物(10 μM)和反向引物(10 μM)各1 μL，ddH2O 11.25 μL。PCR程序：98℃30 s；98℃15 s，50℃30 s，25～27個循環；72℃ 30 s，72℃5 min，于4℃保存。PCR擴增結果進行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對PCR產物在Microplate reader (BioTek，FLx800)上進行定量，然后按照每個樣品所需的數據量進行混樣。利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構建文庫。在Agilent Bioanalyzer機器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫做2100質檢，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上對文庫進行定量，合格的文庫在MiSeq機器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進行2×300 bp的雙端測序。

1.4 數據統計與分析

運用R軟件對測序數據進行分析。首先對所獲序列預處理，評估有效序列質量，獲得可用于后續分析的高質量序列；然后對高質量序列按照97%的序列相似度劃分可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)；再將豐度值高于0.001%的OTU代表序列與細菌16S rRNA基因數據庫的模板序列進行比對，即可獲取每個OTU所對應的分類學信息。

細菌群落多樣性選擇Chao1，ACE，Shannon和Simpson4個指數進行分析。Chao1豐富度指數通過計算群落中只檢測到1次和2次的OTU數(即“Singleton”和“Doubleton”)，估計群落中實際存在的物種數；ACE豐富度指數默認將序列量10以下的OTU都計算在內，從而估計群落中實際存在的物種數；多樣性指數Shannon和Simpson綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，前者對群落豐富度和稀有OTU更敏感，后者對均勻度和群落中的優勢OTU更敏感。

文中數據均以“均值±標準差”表示。通過IBM SPSS statistics 20.0對不同處理組數據進行多重比較，通過SigmaPlot12.0進行制圖。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌組合處理對苜蓿青貯細菌群落結構的影響

高通量測序結果顯示，21個苜蓿青貯樣品獲得46 551～63 375個有效序列(合計1 194 775個)，物種累計曲線最終趨于平緩，說明樣本量足以反映群落的豐富度，且所有的OTU均可歸屬至已知分類單元(門、綱、目、科、屬)。

由表1可知，CK，L1P1，L1P2，L2P1，L2P2，P1B和P2B的OTU總數分別為347，442，449，468，502，383，460個，其中P2B處理與CK的共有OTU數占比最高(58.26%)，其次是P1B(48.56%)，然后依次是L1P2(39.20%)，L2P2(38.05%)，L2P1(29.35%)，L1P1(20.81%)，說明含凝結芽孢桿菌的處理與對照組菌群相似性較高。由表2可知，對OTU進行劃分及分類地位鑒定，在門、綱、目、科及種水平下，OTU數量均表現為L1P2處理顯著高于CK(P<0.05)，其他處理組間差異均不顯著，而在屬水平OTU數量各處理組間差異均不顯著；對各分類水平的細菌類群數量進行統計，門、目、科、屬水平細菌類群數量處理組間差異均不顯著，在綱水平上細菌類群數量表現為L1P2和L2P1處理顯著高于P2B處理(P<0.05)，其他處理組間差異均不顯著，在種水平上細菌類群數量表現為CK顯著高于L2P2處理(P<0.05)。

2.1.1門水平細菌組間差異 由苜蓿青貯在門水平相對豐度的組間差異(表3)可知，各處理均以厚壁菌門(Firmicates)相對豐度最高，為69.3%～83.1%，然后是藍細菌門(Cyanobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)，分別為3.9%～26.4%和0.4%～14.6%，而放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、綠彎菌門(Chloroflexi)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)相對豐度均小于2%(數據未在表3中體現)。其中，厚壁菌門相對豐度在組間差異均不顯著；藍細菌門表現為L1P1處理顯著高于CK和P2B處理(P<0.05)；而變形菌門表現為P2B處理和CK顯著高于除P1B外的其他處理(P<0.05)。綜合而言，各處理的優勢菌門均為厚壁菌門，乳酸菌處理組的次優勢菌門為藍細菌門。

表1 乳酸菌組合處理苜蓿青貯細菌序列(OTU)與對照的對比關系

表2 苜蓿青貯樣品細菌序列(OTU)劃分及細菌類群分類地位統計

表3 苜蓿青貯細菌群落門水平相對豐度的組間差異

2.1.2屬水平細菌組間差異 分析苜蓿青貯組間相對豐度有顯著差異的目/科/屬共有28個，其中相對豐度大于1%的屬詳見表4。由表4可知，乳桿菌屬(Lactobacillus)在L1P1，L1P2，L2P1，L2P2處理顯著高于CK及P1B和P2B處理(P<0.05)，其他組間差異均不顯著；片球菌屬(Pediococcus)在P2B處理最高，然后依次是P1B和CK，三者差異不顯著，均顯著高于L1P1和L2P1處理(P<0.05)，P2B顯著高于L1P2(P<0.05)，P2B和P1B均顯著高于L2P2(P<0.05)；腸球菌屬(Enterococcus)在P1B處理顯著高于除CK和P2B以外的其他處理(P<0.05)；乳球菌屬(Lactococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度均表現為CK顯著高于其他各處理(P<0.05)；棒球菌屬(Corynebacterium)相對豐度則表現為P1B處理顯著高于其他處理(P<0.05)；野豌豆屬(Viciafaba)表現為CK顯著低于除P1B和P2B外的其他處理(P<0.05)。

由此可見，CK的優勢菌群為片球菌屬，相對豐度為43.5%，次優勢菌群為乳桿菌屬(23.9%)；P1B和P2B處理優勢菌群為片球菌數，相對豐度分別為46.9%，49.7%，次優勢菌群是乳桿菌屬(20.2%，15.7%)和野豌豆屬(10.1%，14.6%)；L1P1，L1P2，L2P1，L2P2處理的優勢菌則為乳桿菌屬，相對豐度分別為49.2%，43.8%，55.2%，54.2%，次優勢菌群是片球菌屬(21.5%，28.1%，16.8%，24.8%)和野豌豆屬(24.9%，23.1%，22.9%，17.5%)。CK，L1P1，L1P2，L2P1，L2P2，P1B，P2B處理優勢乳酸菌群(乳桿菌屬+片球菌屬)的相對豐度分別為67.4%，70.7%，71.9%，72.0%，79.0%，67.1%，65.4%。

表4 苜蓿青貯細菌群落屬水平相對豐度的組間差異

2.2 苜蓿青貯樣品細菌群落多樣性

Chao1指數和ACE指數可體現群落豐富度，Shannon指數和Simpson指數兼顧群落豐富度和均勻度。由表5可知，苜蓿青貯樣品的細菌群落Chao1指數和ACE指數在添加劑處理均較CK有所增加，其中Chao1指數在L1P2處理顯著高于CK(P<0.05)，ACE指數在L1P2處理顯著高于P1B處理和CK(P<0.05)；Simpson和Shannon指數在添加劑處理均較CK有所下降但差異未達顯著水平。

表5 苜蓿青貯樣品細菌多樣性指數

對不同處理苜蓿青貯樣品的細菌豐度和細菌群落組成進行基于Unifrac距離的NMDS非度量多維尺度分析，結果表明，除L2P2處理外其他各組內差異均相對較小，其中CK獨立分為一組，P2B和P1B處理分為一組，距離CK較近，L1P1，L1P2，L2P1組距離較近，可分為一組(圖1)。

圖1 不同苜蓿青貯樣品微生物豐度的NMDS分析圖

2.3 苜蓿青貯細菌群落結構及多樣性與其營養品質的關系

2.3.1細菌群落結構 由表6可知，厚壁菌門和藍細菌門的相對豐度與苜蓿青貯營養和發酵指標之間的相關關系均未達顯著水平，但變形菌門的相對豐度與苜蓿青貯粗蛋白、非纖維性碳水化合物及乳酸含量極顯著負相關(P<0.01)，而與中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、灰分、pH值和乙酸含量極顯著正相關(P<0.01)，說明變形菌門豐度的增加容易造成養分損失，降低乳酸含量增加乙酸含量，不利于纖維分解和pH值的降低，對發酵品質提升不利。

2.3.2細菌群落多樣性 由表7可知，Chao1和ACE指數與苜蓿青貯非結構性碳水化合物含量極顯著負相關(P<0.01)，說明苜蓿細菌群落豐富度的增加會導致非結構性碳水化合物的降低；Simpson指數與各營養指標之間的相關關系均未達到顯著水平；Shannon多樣性指數兼顧細菌群落豐富度和均勻度，對稀有菌群敏感，與粗蛋白含量極顯著負相關(P<0.01)，與乳酸含量顯著負相關(P<0.05)，與中性洗滌纖維和乙酸含量顯著正相關(P<0.05)，說明苜蓿青貯雜菌數量增加引起的Shannon多樣性指數的提高，會導致其蛋白損失，乙酸含量增加，且不利于纖維可消化性的提高及乳酸的積累。

表6 苜蓿青貯樣品細菌群落結構與營養品質的關系

表7 苜蓿青貯樣品細菌群落多樣性與營養品質的關系

3 討論

發酵過程即微生物群落的演替過程，經過最初的有氧發酵和后續的厭氧發酵階段，不良菌群減少，乳酸菌開始主導發酵過程產生大量乳酸[30]。據報道，青貯飼料中參與乳酸發酵的菌群大多數屬于厚壁菌門[28]，其與變形菌門和藍細菌門共同構成了鮮苜蓿的主要附生細菌群落[18,27]，發酵后厚壁菌門逐漸占優勢[13,28]。本研究結果與之相似，各苜蓿青貯中細菌群落也是以厚壁菌門(Firmicates)為主，其次是藍細菌門(Cyanobacteria)，經鑒定主要為Viciafaba屬，推斷其應該是來自于苜蓿青貯的植物樣本部分，第三大類群為變形菌門(Proteobacteria)，僅在對照組和P2B處理相對豐度大于10%。變形菌門部分菌屬可通過脫氨反應生成氨，減緩pH值的降低[23]，同時可與乳酸菌競爭可利用的水溶性碳水化合物[17]，故其相對豐度與苜蓿青貯非纖維性碳水化合物含量極顯著負相關而與pH值極顯著正相關(表6)，這與閆晶等[31]研究中認為變形菌門與pH成正相關的結果相似。

不同添加劑種類會導致青貯微生物群落結構的差異[30]。乳酸菌是青貯發酵成功的關鍵微生物[32]，主要通過增加群落乳酸菌豐度促進乳酸發酵而實現抑制有害菌繁殖、保存青貯物料的目的[29]。一般而言，在不應用青貯添加劑的情況下，青貯優勢菌群主要受植物附生菌影響，而附生菌因氣候、地理位置、管理措施等多方面因素而存在較大的異質性[18,27]。Ni等[33]研究報道腸球菌科(Enterococcaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)是鮮苜蓿的主要附生菌群；馬召穩等[13]研究報道含水量65%的苜蓿青貯微生物群落在屬水平上主要為海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacilli)、芽孢桿菌屬(Bacilli)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、乳酸球菌屬(Lactococcus)等；Agarussi等[17]研究報道萎蔫的苜蓿青貯中植物乳桿菌(L.plantarum)占優勢，同時也鑒定出乳酸片球菌(P.acidilactici)和戊糖片球菌(P.pentosaceus)等其他乳酸菌。本研究中，對照組未添加任何外源添加劑的情況下，其優勢菌為片球菌屬(Pediococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)，說明苜蓿自身附著的細菌中有二者的存在，且推斷在發酵過程中片球菌的作用大于乳桿菌，故青貯后片球菌屬的相對豐度顯著高于乳桿菌屬。據報道，在應用乳酸菌劑后，苜蓿青貯優勢菌群基本上是添加劑中使用的乳酸菌，如植物乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌(E.faecium)等[17,24]。本研究所用的乳酸菌組合中，含凝結芽孢桿菌處理的優勢乳酸菌為片球菌屬，其次是乳桿菌屬，即在片球菌與凝結芽孢桿菌共同添加的情況下，片球菌屬具有一定的優勢，但芽孢桿菌屬相對豐度甚至低于對照組(表4)，推測芽孢桿菌屬包括凝結芽孢桿菌的繁殖在苜蓿青貯過程中被抑制，可能其不宜應用于苜蓿青貯中；含植物乳桿菌處理的優勢乳酸菌均為乳桿菌屬，其次為片球菌屬，說明在植物乳桿菌和片球菌共同添加的情況下，植物乳桿菌的優勢明顯。

外源添加劑處理可影響細菌群落多樣性，且不同的多樣性指數變化趨勢不同[27]。有研究表明，苜蓿經γ射線+外源菌劑處理后青貯微生物Chao1和Shannon指數降低，而僅添加外源菌劑處理與對照差異不顯著[18]；接種植物乳桿菌或布氏乳桿菌可增加苜蓿青貯優勢菌屬的豐度從而降低細菌群落多樣性[28]。本研究中，苜蓿青貯菌群豐富度均較對照有所提高，菌群豐富度的增加可能導致更多青貯發酵底物的消耗，表現在營養成分上就是非結構性碳水化合物的降低，故菌群豐富度指數與苜蓿青貯非結構性碳水化合物含量極顯著負相關(表7)；對優勢度敏感的菌群Simpson多樣性指數與苜蓿青貯營養指標的相關關系均不顯著(表7)；但對稀有菌群敏感的菌群Shannon多樣性指數卻與粗蛋白及乳酸含量極顯著或顯著負相關，與中性洗滌纖維和乙酸含量顯著正相關(表7)，說明該指數的增加不利于苜蓿青貯品質相關指標的提升。

乳酸菌是一類能夠利用碳水化合物發酵產生大量乳酸的細菌，不同乳酸菌在青貯中的作用不同，有的乳酸菌代謝產物可抑制霉菌生長，有的可以抑制氨的產生等[7]。本研究中，凝結芽孢桿菌組與對照組距離較近(圖1)，說明其對苜蓿青貯菌群結構的影響較小，甚至在一定程度上降低了苜蓿青貯中乳桿菌屬的相對豐度(表4)；含植物乳桿菌組距離對照組和凝結芽孢桿菌組均較遠(圖1)，說明植物乳桿菌對苜蓿青貯菌群結構的影響較大，無論哪個含有植物乳桿菌的處理，苜蓿青貯后乳桿菌屬的相對豐度均較對照組顯著增加(表4)。

4 結論

通過對添加6種乳酸菌組合的苜蓿青貯樣品細菌群落結構進行分析，各乳酸菌組合的應用均在一定程度上改善了苜蓿青貯的細菌群落結構，其優勢乳酸菌群均為厚壁菌門(Firmicates)的乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)，二者相對豐度之和為65.4%～79.0%，其中含植物乳桿菌的組合效果優于含凝結芽孢桿菌的組合。