高寒地區人工草地土壤微生物群落對不同種植方式和年限的響應

張杰雪， 王占青， 全小龍， 梁 軍， 史惠蘭， 陳夢詞， 喬有明*

(1. 青海大學省部共建三江源生態和高原農牧業國家重點實驗室， 青海 西寧 810016；2. 青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016；3. 青海大學生態環境工程學院， 青海 西寧 810016)

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，參與并推動環境中物質與能量的流動和轉換[1]。健康的土壤微生物群落不僅有助于維持土壤生態系統的穩定，還能提高土壤對生態環境惡化的緩沖能力，維護生態平衡[2-3]。由于自然和人為因素，人工草地和天然草地一樣面臨著退化的問題。人工草地的退化不僅會引起草地植物群落結構變化和牧草產量、質量下降[4]，還會導致土壤養分、土壤微生物群落結構等變化[5-7]。研究高寒地區多年生人工草地土壤微生物多樣性變化對保護和管理該地區人工草地、改善土壤狀況、保持土壤穩定性具有重要實踐意義。

植物群落可通過其根際的生理過程以及根系分泌物等化感物質影響土壤微生物群落的結構和組成，而土壤微生物也會通過其自身的生理生化作用或分泌一些激素等物質對植被產生影響[8]。通過對川西北高寒牧區紫花苜蓿(Medicagosativa)人工草地、燕麥(Avenasativa)人工草地以及天然草地土壤微生物多樣性研究，伍文憲等[9]認為草地植被類型可改變地下土壤微生物的群落結構。有研究發現，不同種植方式或不同生長年限的人工草地之間土壤微生物特性及其養分含量也存在顯著差異[10-11]。隨著生長年限的增長，細菌逐漸減少，而真菌逐漸增加，進一步影響土壤肥力和生態系統平衡[12]。這些研究主要利用傳統的培養方法或采用磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)法對微生物進行測定，只能判斷細菌、放線菌和真菌3大類的變化情況，不能鑒別到門及以下的分類水平。

高通量測序技術根據細菌16S和真菌ITS區域，經提取、擴增、純化、定量、均一化細菌和真菌的基因序列，再經測序、過濾、優化、聚類，對比基因庫中的已知序列，從而鑒別細菌和真菌種(屬)類，并可鑒別到那些室內不可培養的微生物種類，是傳統培養方法所獲得微生物數量的十倍甚至數百倍，能準確靈敏地檢測土壤細菌和真菌。青海高寒地區人工草地建植和退化草地的恢復主要通過種植多年生禾本科牧草，如垂穗披堿草(Elymusnutans)、草地早熟禾(Poapratensis)、中華羊茅(Festucasinensis)和冷地早熟禾(Poacrymophila)等。除種子生產外，絕大多數采用混播方式，因管理利用不當或土壤肥力和化感等方面的因素，存在人工草地種植2～3年后快速退化的問題[13]。為此，本研究采用高通量測序技術，從土壤微生物群落的角度，研究土壤微生物在牧草不同種植方式下隨生長年限的變化，以期揭示高寒地區人工草地退化的潛在驅動原因。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

研究地點位于青海省牧草良種繁殖場(35°09′ N，100°39′ E)，屬于青海省海南州同德縣巴灘地區，總面積243 km2，其中耕地面積100 km2，天然草地129 km2。海拔3 300～3 500 m，年均降水量429.8 mm，年均溫0.2℃，牧草生長季內活動積溫1 309℃，無絕對無霜期。冬春干旱、寒冷，夏季涼爽，雨熱同季，有利于優良牧草生長。場內地勢平坦，土層厚度70～150 cm，土壤為暗栗鈣土，適宜種植優良牧草種子繁殖，如垂穗披堿草、冷地早熟禾、中華羊茅、‘同德’老芒麥(Elymussibiricus‘Tongde’)等。青海省牧草良種繁殖場于每年五月中下旬播種，種子田播種前施底肥磷酸二銨150 kg·km-2和尿素112.5 kg·km-2，每年八月下旬進行種子收獲。種子生產田中牧草生長3年后更換種植的牧草種類，多年生人工草地在前3年有施肥，3年后不再進行施肥，無除草、追肥等管理措施。

1.2 樣品采集

于2019年8月底在青海省牧草良種繁殖場進行樣品采集，采樣前3天未下雨，每個樣地面積為100 m × 200 m。其中單播處理為種子生產田，混播處理為多年生人工草地。調查并記錄每個樣地種植的牧草種類等信息(表1)。在每個樣地隨機選取5個采樣點進行土壤取樣，樣點相隔距離15 m以上，采集土壤深度為0～20 cm的土壤。每個樣點分別采集土壤微生物分析樣品和化學性質分析樣品，微生物分析樣裝于無菌管中，放入—4℃的便攜式冰箱中，帶回實驗室保存于—20℃的貯藏箱中；化學性質土樣裝入自封袋帶回實驗室，風干過篩后進行土壤pH、有機碳、硝態氮、銨態氮和速效磷含量測定。

1.3 測定方法及指標

1.3.1土壤化學性質的測定 土壤酸堿度用pH計(PHS-3E)測定，土壤有機碳含量用重鉻酸鉀-硫酸容量法[14]測定，總氮含量用凱氏定氮法測定，硝態氮含量用氯化鉀-硫酸肼還原法測定，銨態氮含量用氯化鉀-水楊酸鈉法測定，速效磷含量用碳酸氫鈉-鉬銻抗比色法測定[15]。以每個樣地的5個樣品作為土壤化學性質測定的5次重復。

表1 樣品采集地信息

1.3.2土壤微生物的測定 從—20℃的貯藏箱中取出裝有土樣的無菌管，在超凈工作臺中取無菌管中的土壤5 g左右，去除植物根和石礫后裝于5 mL的無菌管中，放置在裝有干冰的泡沫箱中寄到諾禾致源公司天津總部，采用16S/ITS擴增子測序分析技術測定土壤微生物的多樣性。每個樣地隨機選取了3個樣品，即3次重復。不同處理的樣品編號見表1。

1.4 數據處理與分析

土壤化學性質數據利用SPSS 20.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用最小顯著性差異法(LSD)進行處理間差異顯著性比較。對同一種植方式不同生長年限土壤的微生物數據進行合并處理，然后進行比較。微生物數據的作圖通過R3.6.1完成，RDA分析用Canoco 5.0完成。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質

本研究的6個樣地土壤化學性質如表2所示，土壤pH在8.5～9.0之間，偏堿性。土壤總氮含量介于2.17～2.75 g·kg-1之間，有機碳含量介于13.05～22.28 g·kg-1之間，速效磷含量介于9.78～37.12 mg·kg-1之間。中華羊茅和短芒披堿草單播草地不同生長年限土壤有機碳、總氮和銨態氮含量無顯著差異，硝態氮和速效磷含量隨生長年限增長顯著降低(P<0.05)；混播草地土壤總氮含量無顯著變化，土壤有機碳、銨態氮和硝態氮含量隨生長年限增長顯著降低(P<0.05)，速效磷顯著增加(P<0.05)。

表2 土壤的基本化學性質

2.2 土壤微生物群落比較

2.2.1微生物OTU數目 細菌OTU聚類分析發現：不同種植方式土壤共有7 963個OUT，共同包含的OTU數為4 526個，單播草地和混播草地土壤的OUT均在6 100～6 300個之間，沒有表現出明顯的差異。6個樣地土壤共同包含的OTU數為2 763個(圖1)。無論是單播草地還是混播草地，土壤細菌種類隨生長年限而減少，即FsMono1 > FsMono2，EbMono1 > EbMono2，MixS1 > MixS2。

真菌OTU聚類分析表明，不同種植方式土壤共有5 609個OUT，共同包含的OTU數為1 608個，中華羊茅和中華羊茅+短芒披堿草+冷地早熟禾混播草地土壤的真菌OUT數在3 500～3 600個之間，而短芒披堿草單播草地的土壤真菌OUT數明顯少于前兩者，不到3 000個。6個樣地土壤共同包含的真菌OTU數有658個(圖1)。種植中華羊茅的草地土壤真菌類群數量較接近，一致性高；但短芒披堿草和混播群落土壤真菌類群呈現隨生長年限增長而增加的趨勢，即土壤中所含OTU數MixS2 > MixS1，EbMono2 > EbMono1。

圖1 土壤細菌(16S)和真菌(ITS) OTU數量的韋恩圖

2.2.2微生物多樣性 土壤微生物的多樣性結果顯示，不同種植方式間的土壤細菌Shannon指數和Chao1指數均沒有顯著差異，中華羊茅單播草地土壤細菌豐富度隨生長年限增長而減小(表3)。土壤真菌Shannon指數以混播草地最高，中華羊茅單播草地次之，混播草地土壤真菌多樣性顯著高于短芒披堿草草地的(P<0.05)，土壤真菌豐富度Chao1指數以中華羊茅單播草地最高，混播草地次之，混播草地土壤真菌豐富度顯著高于短芒披堿草草地的(P<0.05)，同一種植方式下生長年限對土壤真菌多樣性和豐富度無顯著影響(表4)。表3與表4的結果顯示各樣點的覆蓋率均在99.0%以上，說明各樣地的微生物物種信息基本得到了充分的體現。

2.2.3微生物群落結構 細菌分析(16S)共檢測出63個門，68個綱，143個目，270個科，684個屬，478個種，對細菌OTU的注釋結果顯示，在所有的處理中，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和己科河菌門(Rokubacteria)等10個門的細菌占了所有細菌的95%，其中，變形菌門、放線菌門和酸桿菌門占了大約67%的比例(表5)，是不同生長年限的人工草地土壤中的優勢細菌。在變形菌門中，α變形菌(Alphaproteobacteria)占比最高，其次為γ變形菌(Gammaproteobacteria)，而δ變形菌(Deltaproteobacteria)占比最低。不同種植方式和年限土壤細菌占比分析顯示(表5，表6)，不同種植方式單播和混播草地土壤細菌門無顯著差異，短芒披堿草單播草地土壤短波單胞菌屬(Brevundimonas)顯著高于中華羊茅單播草地和混播草地(P<0.05)?；觳ゲ莸赝寥谰G彎菌門占比隨生長年限顯著增加(P<0.05)，短芒披堿草單播草地短波單胞菌屬和芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)占比隨生長年限顯著減小(P<0.05)，中華羊茅單播草地和混播草地土壤細菌門和屬無顯著變化。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)為6個樣地土壤共同擁有的優勢菌屬。

表3 不同種植方式和年限土壤細菌多樣性指數比較

表4 不同種植方式和年限土壤真菌多樣性指數比較

真菌分析(ITS)共檢測出17個門，56個綱，128個目，275個科，558個屬，646個種，真菌在樣品間的變異較大，在所有處理中，子囊菌門(Ascomycota)為絕對的優勢門，約占到了所有真菌的31%，擔子菌門(Basidiomycota)位居其次，所占比例大約為10%，被孢霉門(Mortierellomycota)約占7%，還有約50%未鑒定到門水平的真菌，而其余的門所占比例不到2%。不同種植方式和年限土壤真菌占比分析顯示(表5，表6)，混播草地子囊菌門占比顯著高于短芒披堿草單播草地(P<0.05)，中華羊茅單播草地土壤鐮刀菌屬(Fusarium)占比顯著高于短芒披堿草和混播草地的占比(P<0.05)。中華羊茅單播草地土壤擔子菌門的占比隨年限顯著減小(P<0.05)，混播草地土壤鐮刀菌屬占比隨年限顯著減小(P<0.05)。

表5 不同種植方式土壤微生物在門和屬水平上的豐度變化

2.3 土壤化學性質與微生物群落的關系

土壤細菌群落與土壤化學性質RDA分析顯示，軸一和軸二的解釋變量分別為27.75%和23.03%(圖2)，環境因子中土壤pH、總氮、硝態氮和速效磷對細菌群落的影響最大，而土壤銨態氮、有機碳對細菌群落的影響不顯著；芽單胞菌門、己科河菌門、奇古菌門和酸桿菌門與土壤總氮、銨態氮和有機碳含量呈正相關，綠彎菌門和放線菌門與土壤pH、速效磷含量呈正相關，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門與硝態氮含量呈正相關，擬桿菌門與土壤有機碳含量呈正相關。

土壤真菌群落與土壤化學性質RDA分析顯示，軸一和軸二的解釋變量分別為34.17%和25.97%(圖2)，土壤pH、總氮、有機碳和硝態氮對真菌群落影響最大，土壤速效磷和銨態氮對真菌群落的影響不顯著；擔子菌門與土壤pH、硝態氮和速效磷含量呈正相關，與有機碳、銨態氮、總氮呈負相關，壺菌門(Chytridiomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、芽枝霉門(Blastocladiomycota)和毛霉門(Mucoromycota)與土壤pH呈正相關，土壤總氮含量與子囊菌門、被孢霉門、捕蟲霉門(Zoopagomycota)、Aphelidiomycota、球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門、油壺菌門、芽枝霉門和毛霉門呈正相關，子囊菌門、被孢霉門和捕蟲霉門與土壤有機碳和銨態氮含量呈正相關。

表6 不同樣地土壤微生物在門和屬水平上的豐度變化

圖2 土壤微生物群落與土壤化學性質的冗余分析

豐度排名前35的細菌屬與環境因子之間的Spearman分析表明(圖3)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)與土壤總氮含量呈極顯著負相關關系(P<0.01)，Haliangium與土壤總氮呈顯著負相關關系(P<0.05)；Acidibacter與土壤銨態氮含量呈顯著負相關關系(P<0.05)，慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)與土壤硝態氮含量呈顯著正相關關系(P<0.05)。

豐度排名前35的真菌屬與環境因子之間的Spearman分析結果顯示(圖4)，被孢霉屬(Mortierella)和細基格孢屬(Ulocladium)與土壤pH呈顯著負相關關系(P<0.05)；假雨盤菌屬(Pseudombrophila)與土壤pH呈極顯著負相關關系(P<0.01)；假絲酵母屬(Candida)和Kernia與土壤pH分別呈極顯著正相關關系(P<0.01)和顯著正相關關系(P<0.05)。黑粉菌屬(Ustilago)與有機碳含量呈顯著負相關關系(P<0.05)；Fusicolla和Neonectria與土壤有機碳含量均呈顯著負相關關系(P<0.05)；Dactylonectria與土壤有機碳含量呈極顯著正相關(P<0.01)。Pseudogymnoascus與土壤總氮含量呈顯著正相關關系(P<0.05)；Clonostachys與土壤總氮含量呈顯著正相關(P<0.05)；麥角菌屬(Claviceps)與土壤總氮含量呈極顯著正相關(P<0.01)；細基格孢屬與總氮含量呈極顯著負相關關系(P<0.01)；踝節菌屬(Talaromyces)與土壤總氮含量呈顯著正相關關系(P<0.05)。鐮刀菌屬和附球霉屬(Epicoccum)與土壤銨態氮含量均呈顯著負相關關系(P<0.05)；Dactylonectria與土壤銨態氮含量呈顯著正相關關系(P<0.05)；附球霉屬(Epicoccum)與土壤銨態氮含量呈顯著負相關關系(P<0.05)。放射毛霉屬(Actinomucor)與土壤硝態氮含量呈極顯著正相關關系(P<0.01)；Pseudogymnoascus與土壤硝態氮含量呈極顯著負相關關系；Clonostachys與土壤硝態氮含量呈顯著負相關關系(P<0.05)；麥角菌屬與土壤硝態氮含量呈極顯著負相關關系(P<0.01)；細基格孢屬與土壤硝態氮含量極顯著正相關關系(P<0.01)；假絲酵母屬與土壤硝態氮含量呈顯著負相關關系(P<0.05)；Boeremia與土壤硝態氮含量呈顯著正相關關系(P<0.05)；Kernia和油壺菌屬(Olpidium)與土壤硝態氮含量均呈顯著負相關關系(P<0.05)。Solicoccozyma與土壤速效磷呈顯著負相關關系(P<0.05)。微生物屬水平Spearman相關性分析結果顯示，環境因子對真菌的影響比對細菌更為顯著。

圖3 土壤細菌屬水平Spearman分析

圖4 土壤真菌屬水平Spearman分析

3 討論

3.1 不同種植方式和年限土壤微生物群落變化

土壤微生物是土壤有機質的主要分解者，也是土壤養分的重要源和匯，受土壤環境影響[16]。本研究檢測出的細菌OTU數以及種類均高于真菌的，表明高寒地區多年生人工草地土壤微生物類群以細菌為主，這與楊希智[17]、韓玉竹[18]和胡雷[19]等有關高寒草地土壤微生物的研究結果一致。單播草地和混播草地的細菌OTU數均隨生長年限增長而減少，短芒披堿草和混播群落土壤真菌OTU數呈現增加趨勢，這與馬欣[20]的結果一致，隨著生長年限的增長，土壤中細菌生長環境變差，細菌生長受阻從而促進了真菌生長[12]。短芒披堿草單播草地的土壤真菌OUT數明顯少于中華羊茅和混播草地的，這與牧草種類以及生長年限[12]有關。

Shannon指數可以用來估算樣品中微生物的多樣性[21]，Chao1指數表示土壤微生物的豐富度[22]，本研究不同種植方式土壤細菌多樣性和豐富度均沒有顯著差異，表明在該地區無論是單播還是混播多年生禾草對土壤細菌群落沒有顯著影響。中華羊茅單播草地土壤細菌豐富度隨生長年限的增長逐漸降低，這與周寶利等[12]關于土壤細菌變化的研究結果相似，與土壤肥力衰退有關。短芒披堿草單播草地和混播草地細菌多樣性和豐富度均在年限上未發現顯著變化，可能與本研究的年限較短有關。在檢測到的63個細菌門中，變形菌門是土壤中豐度最高的細菌類群，這一結果與其他學者關于草地土壤細菌多樣性的研究一致[23]。研究發現短芒披堿草單播草地短波單胞菌占比隨年限減小，混播草地土壤綠彎菌門占比隨年限顯著增加，這與耿德洲等[24]和趙帆等[25]的研究結果一致，可能與土壤中速效磷含量變化相關。

真菌多樣性和豐富度分析結果顯示，混播草地顯著高于短芒披堿草草地，這與植物群落多樣性對土壤微生物的影響結果相同，植物群落多樣性增加可以提高土壤微生物多樣性[26-27]。中華羊茅單播草地真菌多樣性和豐富度均顯著高于短芒披堿草草地的，但生長年限對土壤真菌多樣性和豐富度無顯著影響，也可能是本研究研究的生長年限短，土壤真菌尚未發生顯著變化。高雪峰等[23]和伍文憲等[8]分別在短花針茅(Stipabreviflora)荒漠草原和川西北高寒牧區不同人工草地土壤微生物群落研究中發現子囊菌門、擔子菌門是優勢真菌類群。本研究中，6個樣地的土壤優勢真菌門按照豐富度由高到低排列順序依次為子囊菌門>擔子菌門>被孢霉門。子囊菌門與擔子菌門大多數為腐生菌，本研究的土壤pH均在8.5～9.0，適合腐生真菌的生長，這可能是子囊菌門與擔子菌門為優勢菌門的一個原因[28]，本研究發現被孢霉門也是較優勢的類群，這和耿德洲等[24]研究結果一致，被孢霉門真菌與土壤有機碳、全氮和銨態氮含量有關，是土壤養分含量豐富標志類群。本研究表明混播草地子囊菌門占比顯著高于短芒披堿草單播草地，與真菌多樣性和豐富度變化一致。納小凡等[29]研究顯示隨著生長年限的增長，擔子菌門的比例顯著下降，本研究中華羊茅單播草地土壤擔子菌門的占比也隨年限減小，發現與土壤硝態氮和速效磷的含量有關。

3.2 土壤微生物群落與土壤理化性質

土壤微生物數量和多樣性的大小也是表征土壤肥力狀況的重要生物學指標，通常情況下，土壤養分與微生物生物量呈正相關[30]。薛凱等[31]關于青藏高原高寒草地土壤微生物群落及影響因子的研究發現，有機碳、銨態氮和速效磷與土壤微生物的多樣性有顯著的相關性，楊希智等[15]和齊文娟等[32]的研究也證實了總氮與速效磷對土壤微生物影響顯著，本研究發現中華羊茅和短芒披堿草單播草地硝態氮和速效磷含量隨著生長年限的增長呈降低趨勢，所以單播草地土壤微生物種類數量和結構的變化主要由硝態氮和速效磷的變化引起。在已有的報道中，變形菌門被認為與碳利用有關，是世界上最為普遍的菌門[5]，本研究發現變形菌門與土壤有機碳、銨態氮含量呈負相關。相關研究還發現酸桿菌門與土壤營養有較大相關性[33]，本試驗也證實了這一點。有研究表明人工草地建植初期，群落處于物種組成簡單，生產力高且較穩定的階段，加之施肥等管理措施，微生物群落結構較簡單，綠彎菌門相對較少，隨著生長年限的增長，綠彎菌門逐漸增加[18]，本研究也發現這一現象，并發現綠彎菌門的豐富度和速效磷有關。土壤養分的變化影響到土壤真菌的變化，中華羊茅草地土壤擔子菌門與硝態氮和速效磷含量變化一致。研究發現土壤化學性質對細菌菌屬影響較小，對真菌菌屬影響較大，鐮刀菌屬隨生長年限的增長逐漸降低，但與土壤銨態氮含量的變化趨勢不一致，這可能受土壤環境中其他因素影響，但是具體原因有待進一步的研究探討。

4 結論

在所研究的高寒地區不同生長年限的單播和混播人工草地土壤中共識別出63個細菌門類、17個真菌門類，約有50%的真菌門未識別出來。已識別類群中細菌以變形菌門、酸桿菌門和放線菌門占優勢，真菌以子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門占優勢。短時間內，不同種植方式下土壤細菌多樣性和豐富度無顯著變化；中華羊茅草地和混播草地土壤真菌多樣性和豐富度顯著高于短芒披堿草單播草地的；同一種植方式混播草地不同生長年限細菌和真菌無顯著變化，單播草地土壤細菌隨年限的增長逐漸減少。高寒地區多年生人工草地土壤微生物多樣性和豐富度顯著受土壤硝態氮和速效磷含量變化的影響。