丙戊酸鈉對50%TBSAⅢ度燙傷大鼠心肌細胞凋亡的影響*

孟祥熙，溫海玲，吳曉明，胡 森

(1.承德醫學院附屬醫院燒傷整形科，河北承德 067000；2.解放軍總醫院第四醫學中心燒傷研究所休克與多器官障礙實驗室，北京 100048)

嚴重燒傷后，有效循環血量減少，組織缺血缺氧，引起心肌損傷、心功能降低、循環功能降低，心肌損害程度與心肌細胞凋亡、炎性反應等密切相關，燒傷早期對心臟功能的保護、提高心肌細胞對缺血缺氧的耐受尤為重要，為后續治療爭取時間[1-3]。以往研究顯示丙戊酸鈉(VPA)能保護失血性休克或致死性燙傷大鼠心肌功能，改善心肌能量代謝，提高生存率，但具體機制仍不明確[4-7]。為此，本實驗通過觀察VPA對50%體表總面積(TBSA)Ⅲ度燙傷大鼠心肌酶指標、心肌細胞凋亡情況及心肌組織內caspase-3活性、一氧化氮合酶(iNOS)表達水平、NO水平的影響，為VPA在嚴重燒傷早期保護心臟功能研究方面提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠，60～70 d齡，體重240～260 g，購進后適應性飼養1周以上，室溫維持在22～25 ℃，自由飲食。實驗前12 h禁食、自由飲水。

1.2 藥品和試劑

VPA、戊巴比妥鈉、caspase-3活性檢測試劑盒(Assay Kit)購自美國Sigma公司；TUNEL檢測陽性對照制備試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；NO檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司；iNOS一抗購自美國Abcam公司；小鼠抗大鼠三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

48只雄性SD大鼠，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，剪除背部和腹部的毛發，將大鼠放置在預制模板的矩形開口，露出裸露皮膚，同時保護剩余皮膚。分為3組(n=16)，(1)假燙組：于37 ℃水浴中背部浸泡15 s，腹部浸泡8 s，浸泡后腹腔內注射0.25 mL生理鹽水;(2)燙傷組：于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s燙傷后，腹腔內注射0.25 mL生理鹽水；(3)VPA 組：燙傷后腹腔給予VPA治療(300 mg/kg，溶于0.25 mL 0.9%生理鹽水)。

1.4 指標檢測

燙傷后3、6 h行腹主動脈穿刺，取血標本；然后處死大鼠，胸正中線剖開取心肌組織。

1.4.1磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平檢測

血標本離心后取血漿，全自動生化分析儀測定血漿CK-MB水平。

1.4.2心肌細胞凋亡率

TUNEL方法檢測凋亡心肌細胞，其原理為熒光素標記的脫氧尿嘧啶核苷酸三磷酸(dUTP)在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3′-OH末端，在熒光顯微鏡下熒光增強。隨機選取心肌組織區域中5個非重疊400高倍鏡視野，計數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數，心肌細胞凋亡率=凋亡心肌細胞數/心肌細胞總數×100%

1.4.3caspase-3活性檢測

casepase-3可以催化底物DEVD-p-NA產生黃色的p-NA，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase-3的活性；按照試劑盒說明書進行操作，405 nm處讀取各管吸光度(A)值，觀察caspase-3活性。

1.4.4NO水平檢測

NO化學性質活潑，遇氧和水生成硝酸鹽(NO3-)和亞硝酸鹽(NO2-)，后兩者遇顯色劑生成淡紅色偶氮化合物，通過比色可間接檢測NO水平。按照試劑盒說明書進行操作混勻后，550 nm處測各管A值，根據公式計算組織NO水平(μmol/gprot)。

1.4.5iNOS表達水平

稱取100 mg大鼠心肌組織，加入1 mL RIPA裂解液勻漿，于冰上靜置20 min后12 000×g離心20 min，吸取上清液并用BCA法進行蛋白濃度測定。行常規十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜，5%脫脂奶粉封閉60 min后分別加入相應一抗：內參蛋白小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(1∶5 000)，兔抗大鼠iNOS抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜；TBST洗3次，每次15 min，然后分別加入相應二抗(1∶5 000)，室溫孵育30 min；TBST洗3次，每天15 min，用超敏ECL化學發光液發光、曝光、顯影、定影，用Image J軟件分析條帶灰度。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 CK-MB水平

與假燙組比較，燙傷組傷后3、6 h CK-MB水平顯著升高(均P<0.05)，而VPA組CK-MB水平較燙傷組顯著降低(均P<0.05)，見表1。

表1 各組血漿中CK-MB水平

2.2 TUNEL染色結果及心肌細胞凋亡率

燙傷組大鼠心肌細胞出現凋亡，肌間隙出現水腫、增寬，肌纖維排列紊亂、斷裂，隨時間增加心肌損傷逐漸加重;而VPA組的病理變化較燙傷組明顯減輕,心肌細胞凋亡數量明顯減少，肌纖維排列整齊,VPA抑制了心肌細胞凋亡，保護了心肌結構及功能，見圖1。燙傷組傷后3、6 h心肌細胞凋亡率顯著高于假燙組(均P<0.05)，且傷后時間越長，心肌細胞凋亡率越高，而VPA處理后心肌細胞凋亡率較燙傷組各時間點明顯降低(均P<0.05)。見表2。

A:假燙組;B:燙傷組3 h;C:VPA組3 h;D:燙傷組6 h;E:VPA組6 h。

表2 各組心肌細胞凋亡率

2.3 心肌組織caspase-3活性

傷后3、6 h，燙傷組caspase-3活性(0.716±0.052、0.912±0.063)顯著高于假燙組(0.435±0.034)，組間比較差異有統計學意義(t=15.167，P=0.036；t=23.734，P=0.011)；而VPA組caspase-3活性(0.527±0.046、0.672±0.047)均顯著低于燙傷組(t=-10.245，P=0.036；t=-11.689，P=0.032)。見圖2。

a：P<0.05，與假燙組比較；b：P<0.05，與燙傷組比較。

2.4 心肌組織iNOS相對表達水平

假燙組心肌內iNOS少量表達(0.38±0.02)，燙傷組傷后3、6 h心肌組織內iNOS相對表達水平明顯增加(1.02±0.05、1.41±0.06)，較假燙組顯著升高(t=45.255，P=0.019；t=55.906，P=0.004)，組間比較差異有統計學意義；而VPA組iNOS相對表達水平顯著降低(0.80±0.07、1.13±0.03)，與燙傷組比較差異有統計學意義(t=-8.312，P=0.001；t=-14.033，P=0.024)。見圖3。

a：P<0.05，與假燙組比較：b：P<0.05，與燙傷組對應時間點比較。

2.5 心肌組織NO水平

與假燙組比較(0.065±0.005)，燙傷組傷后3、6 h心肌組織內NO水平(0.157±0.005、0.237±0.007)顯著增加，組間比較差異有統計學意義(t=43.718，P=0.010；t=71.070，P=0.000)；而VPA治療后NO水平(0.123±0.010；0.203±0.005)較燙傷組均顯著降低(t=-9.874，P=0.008；t=-13.410，P=0.005)。見圖4。

a：P<0.05，與假燙組比較：b：P<0.05，與燙傷組比較。

3 討 論

嚴重血容量丟失、燒/燙傷后，組織及各臟器灌注不足，極易引起心肌細胞的損傷或凋亡[8-10]，在傷員不能及時得到救治的情況下，如果給予抗休克維持藥物提高傷員對休克的耐受能力，保護休克狀態下的組織細胞，維持生命臟器的功能，就能為后繼治療爭取時間，提高生存率。心臟功能的維持及保護，在休克救治過程中尤為重要，如何利用休克維持藥物提高心肌細胞對缺血缺氧的耐受能力、抑制心肌細胞凋亡，成為近年來研究熱點。

VPA是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，近年研究發現，組蛋白去乙酰化酶抑制劑具有細胞保護、抗氧化、抗炎等作用[11-14]。LUO等[15]通過大鼠致死性燙傷模型，證實VPA能增加心臟和大腦中組蛋白H3乙酰化水平，抑制caspase-3活性，保護心臟和大腦功能，提高生存率[15]。本實驗通過建立50% TBSAⅢ度燙傷大鼠模型，研究VPA對心肌細胞凋亡的影響。心臟是維持生命的重要器官，在嚴重燒傷中心臟功能最易受到影響，心肌細胞出現凋亡，心臟功能降低。本實驗研究表明，在大鼠致死性燙傷后，血漿CK-MB、心肌細胞凋亡率顯著升高，VPA治療后，血漿CK-MB水平明顯下降，心肌細胞凋亡率明顯降低，證明VPA能保護致死性燙傷大鼠心臟功能，抑制心肌細胞凋亡。

嚴重燙傷后，心肌細胞缺血缺氧，早期心肌出現功能損傷，心肌不斷丟失，嚴重燙傷早期心功能的損傷與心肌細胞的凋亡有關。caspase-3是重要的促凋亡因子，參與心肌細胞凋亡，活化后發揮凋亡執行因子的作用，標志著細胞凋亡進入不可逆的階段[16]，iNOS在心肌細胞缺血缺氧時表達顯著增加，促進NO合成增加，心肌組織內NO的高水平會通過激活MAPK通路、c-jun通路等多種凋亡通路誘導心肌細胞凋亡、影響心臟功能[17-18]，對心肌組織中caspase-3活性、iNOS的表達及NO水平的檢測，能反映心肌細胞的凋亡情況。研究表明，在傷后心肌組織內caspase-3活性及iNOS、NO水平顯著升高，給予VPA治療后，caspase-3活性水平及iNOS、NO水平顯著降低，因此VPA能降低致死性燙傷大鼠心肌組織內caspase-3活性及NO水平，抑制心肌細胞凋亡，保護心臟功能。

綜上所述，本實驗通過VPA對50% TBSA Ⅲ度燙傷大鼠心臟功能及心肌細胞凋亡影響的研究，證實VPA能保護致死性燙傷大鼠心臟功能，降低心肌細胞凋亡率，其作用機制可能是通過降低心肌組織內caspase-3活性、iNOS表達及NO水平，從而抑制心肌細胞凋亡來實現的。