環(huán)狀RNA在胃癌研究中的意義*

曹 萱，張 徐 綜述，蔣鵬程 審校

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000)

1 環(huán)狀RNA(circRNA)的背景

circRNA最初是在植物病毒中被發(fā)現(xiàn)[1]，由于其是共價閉合且無5′帽子結(jié)構(gòu)和3′末端poly(A)尾巴的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，加之當(dāng)時的技術(shù)限制，一直被認(rèn)為是錯誤拼接的產(chǎn)物[2]。隨著高通量RNA測序(RNA-seq)技術(shù)和生物信息學(xué)分析的發(fā)展和應(yīng)用，科學(xué)家們檢測出越來越多的circRNA，同時發(fā)現(xiàn)其參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，特別是在惡性腫瘤領(lǐng)域。

2 circRNA的類型及形成機制

circRNA根據(jù)來源可為3類：外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA和外顯子-內(nèi)含子circRNA。不過目前，circRNA的成熟機制尚不完全清楚。推測外顯子circRNA是經(jīng)歷反向剪接而形成的[3]。目前有3種假說模型解釋外顯子circRNA的形成：第1種是套索驅(qū)動的環(huán)化，第2種是內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化，第3種是RNA結(jié)合蛋白(RBP)介導(dǎo)的環(huán)化[4]。

3 circRNA的特點

大多數(shù)circRNA是外顯子circRNA。外顯子circRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而少部分內(nèi)含子circRNA和外顯子-內(nèi)含子circRNA則在細(xì)胞核中[4]。目前circRNA還被證實有以下特點：(1)多樣性及豐富性：廣泛存在于真核細(xì)胞中，種類繁多[5]；(2)穩(wěn)定性：circRNA與線性RNA不同，是不帶有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′末端ploy(A)尾巴的單鏈、共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)可能保護(hù)其不易被RNA外切酶(RNaseR)降解，從而比線性RNA具有更高的穩(wěn)定性[6]；(3)保守性：circRNA在不同物種中高度保守[7]；(4)特異性：主要表現(xiàn)在細(xì)胞類型特異性及組織特異性[8]。

4 circRNA的功能

其主要功能是除了充當(dāng)內(nèi)源性競爭RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)，或與miRNA結(jié)合，在細(xì)胞中起到分子海綿的作用外，還有與RBP相互作用等，近年還發(fā)現(xiàn)部分circRNA可以編碼蛋白。隨著大量的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在心血管疾病、阿爾茲海默癥、癌癥等各種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

4.1 充當(dāng)ceRNA或miRNA海綿

circRNA作為ceRNA，競爭miRNA結(jié)合位點，從而減少miRNA與其靶位點的結(jié)合，從而減弱其靶向mRNA的能力。抑制miRNA的這種功能也被稱為miRNA海綿[9]。目前研究circRNA的作用機制主要集中在此功能。大量circRNA也被證實通過此功能在癌癥中發(fā)揮作用。例如：circANKS1B能夠吸附miR-148A-3p和miR-152-3p，充當(dāng)miRNA海綿發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移的作用[10]。circTP63競爭性地與miR-873-3p結(jié)合，作為ceRNA，取消了miR-873-3p對靶基因FOXM1的抑制作用，而升高的FOXM1可促進(jìn)CENPA和CENPB的表達(dá)，進(jìn)而推動細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖[11]。

4.2 與RBP結(jié)合

某些circRNA可以作為蛋白質(zhì)誘餌或者拮抗劑，并通過作為競爭元件來阻斷蛋白質(zhì)的活性[8]。例如：circAmotl1與Stat3在Dnmt3a啟動子區(qū)有共同位點并相互作用，導(dǎo)致了細(xì)胞黏附、遷移、增殖、存活和傷口修復(fù)的增加。不僅如此，circAmotl1還與E2F1、E2F4、EGF、ETS-1、AP1、NF1之間也存在著相互作用[12]。

4.3 翻譯蛋白

因為circRNA缺少5′帽子結(jié)構(gòu)、3′末端poly(A)尾巴,所以一直被認(rèn)為是無翻譯功能。近年發(fā)現(xiàn)，一些circRNA是可以編碼蛋白的。例如：CircPPP1R12A編碼一個功能性蛋白，ZHENG等[13]稱之為CircPPP1R12A-73aa，而體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)可以增強結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的是CircPPP1R12A-73aa而不是circPPP1R12A。最后，證實了circPPP1R12A-73aa是通過激活Hippo-Yap信號通路促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。circSHPRH編碼SHPRH-146aa，SHPRH-146aa可以避免SHPRH被泛素蛋白酶體降解。E3的連接酶SHPRH，可以泛素化增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，從而抑制細(xì)胞惡性增殖行為和降低致瘤性[14]。

5 circRNA與胃癌

胃癌是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，同時位居全世界死亡原因第3名。雖然近年來手術(shù)和化學(xué)治療效果顯著提升，但是由于腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的原因，胃癌患者的5年總生存率依然低于30%[15]，故需要尋求特異性顯著及敏感性強的早期診斷生物標(biāo)志物和新的治療手段。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中有許多表達(dá)異常的circRNA，并調(diào)控著胃癌的發(fā)生發(fā)展,加之circRNA的穩(wěn)定性和組織特異性，均表明了circRNA今后有可能成為一種新的生物標(biāo)記物用于診斷，也可能成為新的治療靶點。

5.1 促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的circRNA

有一部分circRNA在胃癌中呈現(xiàn)高表達(dá)水平，起著促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的作用。WANG等[16]檢測到位于細(xì)胞質(zhì)中的circOSBPL10在胃癌組織中高表達(dá)，并且可以作為胃癌患者總生存期和無病生存期的一個預(yù)后指標(biāo)。CircOSBPL10作為miR-136-5P的海綿促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。ZHU等[17]發(fā)現(xiàn)circNHSL1主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而且在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，與臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與病理T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),同時發(fā)現(xiàn)circNHSL1的表達(dá)水平與miR1306-3p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，而miR-1306-3p的表達(dá)水平又與SIX1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究證實circNHSL1充當(dāng)miR-1306-3p海綿，緩解了miR-1306-3p對SIX1的抑制作用，然后SIX1直接與Vimentin的啟動子區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上增強了Vimentin的表達(dá)，施展增強胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力，促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。據(jù)報道，細(xì)胞周期或凋亡異常可以導(dǎo)致腫瘤的異常增殖。比如：與癌旁組織比較，circPDSS1在胃癌組織中的水平升高。采用流式細(xì)胞儀分析,circPDSS1表達(dá)敲除后，使胃癌細(xì)胞較多分布在G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。circPDSS1過表達(dá)，則結(jié)果相反[18]。

5.2 抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的circRNA

在胃癌中還同樣存在著可以抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的circRNA。circ ZFR成為miR-107和miR-130a的海綿調(diào)節(jié)PTEN可以阻滯細(xì)胞周期，促使細(xì)胞凋亡，然后抑制胃癌細(xì)胞增殖[19]。circRNA_100269之前就被發(fā)現(xiàn)是一種預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物，但其在胃癌中的表達(dá)水平和功能尚不清楚。ZHANG等[20]采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測到circRNA_100269在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下降，后續(xù)試驗證明了其靶向miR-630抑制腫瘤細(xì)胞生長。DAI等[21]從眾多circRNA中篩選出circGRAMD1B，檢測了其在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)circGRAMD1B處于低表達(dá)的狀態(tài)。后來通過一系列實驗證實了circGRAMD1B作為抑癌基因，扮演miR-130a-3p的競爭性內(nèi)源RNA的角色來抑制胃癌細(xì)胞的生長，減弱胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力。

circRNA在胃癌中的差異性表達(dá)，可以預(yù)示著胃癌的發(fā)展，今后很有可能成為一種早期診斷和預(yù)后評估的新的生物標(biāo)志物。然而，關(guān)于胃癌患者血漿中circRNA的研究很少。JIANG等[22]回顧了多個circRNA研究，通過meta分析顯示，這些circRNA的敏感性、特異性和AUC值均在70%以上，確定了circRNA對胃癌有很高的診斷價值。hsa_circ_0021087和hsa_circ_0005051也首次被證實在胃癌組織、細(xì)胞和血漿中的表達(dá)明顯下調(diào)，提示它們可作為一種新的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物應(yīng)用于胃癌的診斷。而且，hsa_circ_0021087在胃癌患者術(shù)前、術(shù)后血漿的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。更加有力地驗證了血液中特異的circRNA可用于早期胃癌的診斷和術(shù)后評估[23]。

5.3 激活信號通路的胃癌相關(guān)circRNA

有時circRNA不只是調(diào)節(jié)靶基因，還可以激活一些癌癥相關(guān)通路發(fā)揮作用。例如：Wnt/β-catenin是一條經(jīng)典的、與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路。LIU等[24]將胃癌組織和細(xì)胞中的circHIPK3表達(dá)水平與其在癌旁組織和正常胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)circHIPK3在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)。根據(jù)收集的隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)circHIPK3的表達(dá)水平和胃癌患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)。沉默circHIPK3不僅可以減弱細(xì)胞的增殖和遷移能力，還能下調(diào)WNT1、TCF4和β-catenin的表達(dá)水平。circHIPK3最終被證明是通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。circMRPS35在胃癌組織中的表達(dá)明顯降低。circMRPS35表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤大小有關(guān)，與FOXO1/3a的表達(dá)呈正相關(guān)。研究證明circMRPS35作為一個支架，將組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT7募集到FOXO1和FOXO3a基因的啟動子上,然后circMRPS35直接與FOXO1/FOXO3a啟動子區(qū)域特異性結(jié)合，在體內(nèi)外發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的能力。GO富集和KEGG通路分析也表明，F(xiàn)OXO信號通路是其相關(guān)性最強的通路。總之circMRPS35是通過調(diào)控組蛋白修飾觸發(fā)了FOXO通路來抑制胃癌的進(jìn)展[25]。

5.4 影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的circRNA

EMT是指上皮細(xì)胞失去黏附等特性，變成具有運動性、遷移性和侵襲性的間充質(zhì)干細(xì)胞。在EMT進(jìn)展過程中E-cadherin等上皮標(biāo)志物表達(dá)減少，而N-cadherin、Vimentin和claudin等間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)增加。還有多種EMT轉(zhuǎn)錄因子(EMT-TF)，包括Snail、Twist和Zeb家族，匯聚成EMT調(diào)控因子。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)EMT參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程[26]。ZHANG等[27]發(fā)現(xiàn)circCACTIN在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯增高。敲除circCACTIN后可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和下調(diào)Vimentin和Snail1的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。過表達(dá)則呈現(xiàn)相反的情況，但對胃癌細(xì)胞的增殖無影響。他們同時還證明了circCACTIN通過競爭ceRNA的機制影響胃癌的進(jìn)展。circHIAT1過表達(dá)可以顯著降低細(xì)胞存活率，促使胃癌細(xì)胞凋亡，還能使E-cadherin水平明顯升高，而N-cadherin，Vimentin和Zeb1水平顯著降低，由此可見circHIAT1還可以抑制EMT的發(fā)生。深入研究發(fā)現(xiàn)circHIAT1除了通過阻礙細(xì)胞生長、抑制EMT過程，還抑制PTEN/PI3K/AKT和ERK信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。另外，還有circ_0000267也可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和EMT過程[29]。胃癌中不同的circRNA的表達(dá)及臨床價值見表1。

表1 胃癌中不同的circRNA的表達(dá)及臨床價值

6 小 結(jié)

circRNA從一開始被認(rèn)為無生物學(xué)功能，到今天成為疾病領(lǐng)域研究熱點，尤其是在癌癥中存在著重大作用并得到科學(xué)家的認(rèn)可。盡管如此，由于circRNA與線性RNA的序列幾乎完全重疊，使得對circRNA的表達(dá)和功能的準(zhǔn)確評估仍然具有挑戰(zhàn)性。例如：外顯子circRNA是通過反向剪接形成，那剪接體是如何特異性地識別circRNA的外顯子，而不是線性RNA的這些外顯子。最近的研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾的circRNA通常來自mRNAs中沒有甲基化的外顯子，而甲基化的mRNA外顯子的circRNA穩(wěn)定性較差，至于 m6A修飾是否會影響circRNA的穩(wěn)定性仍不清楚。circRNA又是如何降解的，以及環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能賦予與它們對應(yīng)的線性RNA哪些不同的功能。circRNA的功能含義只被初步探索，可能是由于研究工具的限制[30]。已有越來越多的研究證明了circRNA與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，預(yù)示著circRNA未來極有可能呈為胃癌新的治療靶點和生物標(biāo)志物。circRNA表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平可與性別、腫瘤大小、浸潤深度、TNM分期、癌胚抗原等相關(guān)。但這些結(jié)果仍然需要在更多的病例中得到證實。目前的研究標(biāo)本主要是腫瘤組織，考慮到采集腫瘤組織操作不便，加之circRNA可存在于唾液、血液等體液中。所以今后可著重檢測體液中circRNA的水平并分析它的敏感度及特異性，研究circRNA更重要的目的是為了早診斷，早治療。目前針對胃癌的治療主要包含手術(shù)治療、化療和放療。手術(shù)治療對于早期胃癌的效果較好。而對于晚期胃癌患者來說則建議選擇新輔助治療，或者單一的放化療。部分患者對化療或者放療不敏感或者耐受性較差，而且抗癌藥物開發(fā)周期較長，如何提高藥物及射線的敏感性也是需要探究的難題。胃癌最讓人困擾的問題就是復(fù)發(fā)。很多患者因為工作、生活、還有胃鏡檢查繁瑣耗時等原因，總是忽略胃鏡檢查。所以尋求檢測胃癌復(fù)發(fā)的新方式也是胃癌治療的重中之重。目前已經(jīng)有一些circRNA被研究者發(fā)現(xiàn)可以用于預(yù)測胃癌復(fù)發(fā)，且改善耐藥。但是circRNA的各種研究最終的目的是應(yīng)用于臨床工作中，所以仍需要大量的試驗、時間來證明。同時也要做好對大眾普及胃癌方面的知識，提高體檢的意識等工作。畢竟胃癌形成的過程復(fù)雜，研究者們也面臨著多方面的挑戰(zhàn)，需要更多時間、精力去攻克。

7 展 望

circRNA的發(fā)現(xiàn)為胃癌研究者、臨床醫(yī)生和胃癌患者帶來了希望，為目前治療方式的“瓶頸期”開拓新的視角，提供了新的思路。盡管現(xiàn)在對circRNA的認(rèn)識還不夠全面，相信隨著新技術(shù)的應(yīng)用和科學(xué)家的不斷努力，circRNA的神奇奧秘終將會被解開。總之，circRNA潛力無窮，未來可期。