納秒脈沖脈寬參數與細胞凋亡的量效關系研究*

張 玉，郭 飛

(1．重慶市中醫院婦科 400021；2.重慶郵電大學復雜系統與仿生控制重慶市重點實驗室 400065)

脈沖電場對細胞、組織及生物體的非熱電效應已成為生物電磁學領域的研究熱點[1-2]。利用電場強度kV/cm、脈寬毫微秒級的電場脈沖作用于生物細胞，導致細胞膜通透性增加，使常態下無法透過細胞膜的物質(如DNA、藥物分子等)順利進入細胞內的現象稱為電穿孔效應。根據穿孔后細胞膜能否恢復常態，將電穿孔分為可逆電穿孔和不可逆電穿孔[3-4]。目前，可逆電穿孔效應已成功應用于基因轉染、藥物導入、細胞融合等領域，并由此產生電化學療法、電基因轉染等新型方法[5-6]。與可逆電穿孔治療腫瘤比較，不可逆電穿孔可獨立殺滅腫瘤細胞，而不需要化療藥物輔助，避免了化療藥物的毒副作用[7-8]，已成功應用于腎癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等實體腫瘤的治療，展現出良好的應用前景[9-11]。

隨著研究的不斷深入，研究者發現當脈沖電場脈寬降低至納秒級，電場強度增至數十kV/cm(納秒脈沖)時可以在細胞膜或細胞器膜上產生更多、尺寸更小的微孔，使得更多小分子物質能夠順利通過細胞膜或細胞器膜，該現象稱之為超級電穿孔[12-13]。利用納秒脈沖誘導細胞發生超級電穿孔，進而誘導細胞凋亡并激發機體免疫反應的原理，在腫瘤治療中具有獨特的優勢[14-17]。目前在離體細胞實驗和動物實驗研究中，采用的典型納秒脈沖參數為脈寬10～600 ns、電場強度20～100 kV/cm、頻率1～10 Hz的方波脈沖[18-19]。研究者多通過經驗或者文獻來選擇納秒脈沖參數，導致在研究中難以獲得理想的效果。目前，納秒脈沖參數與細胞生物電效應之間的量效關系研究仍較匱乏，本文試圖從脈寬角度研究二者間的關系。本文選擇3組總能量相同、但脈寬不同的納秒脈沖作用于SKOV3細胞，通過實驗和仿真計算來研究脈寬參數與細胞凋亡間的量效關系。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑

SKOV3細胞株(重慶醫科大學超聲工程研究所惠贈)；RPMI-1640培養基、胎牛血清、PBS、胰蛋白酶(美國Hyclon公司)；Annexin-V異硫氰熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)；TMRM/JC-1探針試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。

1.2 主要儀器

納秒脈沖源、電極小室(重慶市復雜系統與仿生控制重點實驗室研制，型號NSPG-10K)；示波器(美國Tektronix TDS3032B)；激光掃描共聚焦顯微鏡 (德國Leica TCS-SP2)；流式細胞儀(美國FACS Calibur)；CO2恒溫培養箱(美國Thermo Forma公司)。納秒脈沖源輸出脈沖參數：電壓10 kV，脈寬50～200 ns，頻率1～10 kHz。有關該脈沖源的原理及其輸出波形詳見文獻[20]。電極小室：間距為2 mm，當脈沖源輸出電壓分別為1.4、2.0、2.8 kV時，將依次在電極小室中形成強度為7、10、14 kV/cm 的均勻脈沖電場(分別對應脈寬50、100、200 ns)，將細胞懸液置于其中即可完成脈沖處理。

1.3 方法

1.3.1細胞培養

復蘇SKOV3細胞，培養于含10%胎牛血清的RPMl-l640培養液內，于37 ℃、5% CO2飽和溫濕度箱中培養，隔天換液，2～3 d進行傳代。細胞處于對數生長期時給予0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，收集細胞于離心管中，臺式離心機以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，制成單細胞懸液，于血球計數板上作細胞計數，校正細胞懸液濃度至2×106/mL備用。

1.3.2Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡

按照FITC標記Annexin V細胞凋亡試劑盒的說明書操作，收集對照組及處理組(納秒脈沖處理后孵育6 h)細胞各1×106個，PBS洗滌2遍后，用250 μL Annexin V結合緩沖液重懸細胞，取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加5 μL Annexin V FITC和10 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min，在反應管中加入400 μL PBS，立即用流式細胞儀檢測。以Annxin V+/PI-判斷為早期凋亡，Annxin V+/PI+判斷為晚期凋亡或壞死，Annxin V-/PI+判斷為操作中損傷細胞或處理過于強烈機械性損傷的細胞，Annxin V-/PI-判斷為正常細胞。

1.3.3激光共聚焦檢測細胞膜及線粒體膜電位

分別以TMRM和JC-1探針標記細胞膜及線粒體膜，按照試劑盒說明書進行操作。收集對照組(未用任何處理)及處理組(納脈沖處理后孵育6 h)細胞懸液并分別加入TMRM和JC-1染色液，37 ℃孵育15 min后PBS洗滌細胞兩次并加入少量PBS，采用激光共聚焦掃描顯微鏡實時觀測并記錄細胞膜及細胞內線粒體膜電位熒光變化情況。

1.3.4膜電位、微孔密度及電導率仿真研究

參考文獻[21]，基于球形細胞五層介電模型，同時引入電穿孔效應和細胞組分頻率色散效應，進而記錄細胞膜電導率及介電常數的實時動態變化，來獲取膜電位、微孔密度及電導率動態變化規律。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 不同脈寬參數下細胞凋亡率和壞死率

經納秒脈沖處理后處理組各亞組(50、100、200 ns)細胞凋亡率和壞死率較對照組增加，且處理組各亞組間存在較大差異，100 ns脈沖組誘導最高的凋亡率(32.14±3.76)%，200 ns脈沖組誘導最高的壞死率(24.78±2.36)%。

A:凋亡率；B:壞死率；a：P<0.05,b：P<0.01，與對照組比較。

2.2 激光共聚焦檢測細胞膜和線粒體跨膜電位

50 ns脈沖處理后細胞膜跨膜電位與處理前比較具有一定程度的下降 (P<0.05)，100 ns脈沖處理后細胞膜跨膜電位下降更明顯(P<0.01)，200 ns脈沖處理后，熒光強度值下降最多(P<0.01)。見圖2。不同脈寬的納秒脈沖處理后，線粒體膜電位均出現不同程度的下降，且與脈沖寬度存在一定的關聯。其中，200 ns脈沖處理組熒光強度值較處理前明顯降低(P<0.05)，100 ns脈沖處理組線粒體跨膜熒光強度值下降更加明顯(P<0.01)，50 ns脈沖處理后線粒體跨膜熒光強度值下降最明顯(P<0.01)。見圖3。

A:熒光圖；B：熒光強度分析；a：P<0.05,b：P<0.01,與對照組比較。

A:激光共聚焦；B：熒光強度分析；a：P<0.05,b：P<0.01,與對照組比較。

2.3 跨膜電位、微孔密度及電導率的仿真結果

仿真計算基于球形細胞五層介電模型，考慮引入電穿孔Smoluchowski方程和頻率色散Debye方程，最終通過求解電磁場Laplace方程得出結果。本文仿真計算了上述納秒脈沖參數作用下球形細胞跨膜電位、微孔密度及電導率的變化規律。50 ns脈沖作用時細胞膜跨膜電位上升最快，且在12 ns達到其峰值1.15 V，隨后開始下降至平穩值約1.05 V，最終隨外加脈沖下降而減小；100 ns和200 ns脈沖作用時細胞膜跨膜電位呈現類似的變化規律，但達到峰值時間依次增加且峰值及平穩值依次增大，這是由于50 ns脈沖作用時細胞膜微孔密度及細胞膜電導率增加最為明顯，進而導致穿孔后較低的跨膜電位平穩值。50 ns脈沖作用時細胞器膜跨膜電位增加最為明顯，且隨著脈寬的增加，膜電位上升速度明顯變緩，見圖4。整體來看，隨著脈寬的增加，外加納秒脈沖對細胞膜的影響逐漸增強，而對細胞器膜的影響不斷減弱，與前述細胞實驗結果基本一致。而50 ns脈沖作用時細胞膜上微孔密度最大且電導率最高，是由于此時發生明顯的超級電穿孔效應，與以往研究[22]相符。

A:細胞膜跨膜電位；B：線粒體膜跨膜電位；C：微孔密度；D：細胞膜電導率。

3 討 論

脈沖電場作用致使細胞膜跨膜電位變化是電穿孔效應產生的生物電學基礎，通常認為當細胞膜跨膜電位由靜息電位(約70 mV)上升為0.4～1.0 V時，細胞發生電穿孔效應，進而使細胞膜通透性、電導率急劇增加，最終導致細胞膜、細胞器膜跨膜電位崩潰產生一系列諸如凋亡、壞死的生物電效應[23-24]。因此，跨膜電位的實時變化規律是電穿孔效應研究的關鍵所在，然而受限于測量手段的精度和適應性，目前難以獲得脈沖電場作用時細胞膜及細胞器膜跨膜電位的實時變化規律。實際上，研究者一般通過檢測脈沖作用前后的膜電位或者通過仿真計算脈沖作用時膜電位的變化規律來間接研究電穿孔效應[25-26]。本文以膜電位變化為紐帶，分別從實驗和仿真角度研究了細胞膜和線粒體膜電位變化規律，并對不同脈寬參數下的結果進行分析，最終與實驗中細胞宏觀生物醫學效應建立聯系，從而獲得納秒脈沖脈寬參數與細胞凋亡效應之間的關系規律。

本文選擇3組不同脈寬但能量相同的納秒脈沖進行研究，主要基于以下兩點：(1) 以往仿真及實驗研究表明[27]，當脈沖電場脈寬由毫微秒級降為納秒級時，其作用靶點將由細胞膜轉至胞內細胞器，對于納秒脈沖來說，隨著脈寬降低其作用靶點將逐漸由細胞膜轉至細胞內結構的規律依然存在，因此筆者選擇脈寬參數來進行量效關系研究；(2) 選擇不同脈寬參數，但為了得到可以比較的結果，需保持3組脈沖能量相同，在脈沖個數一定的情況，通過設置不同脈沖場強來實現。

細胞典型的凋亡途徑包括死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑[28]，二者分別與細胞膜和線粒體膜的跨膜電位改變密切相關，即納秒脈沖作用不同靶點將誘導對應的凋亡途徑。本文的實驗和仿真結果均表明，隨著脈寬降低，納秒脈沖作用靶點由細胞膜逐漸轉移至細胞內細胞器；對于100 ns脈沖來說，其將同時有效作用于細胞膜和線粒體膜，從而誘導最大的凋亡效應。而50 ns和200 ns誘導較低凋亡率的一個可能原因是：前者只靶向細胞器膜從而介導線粒體凋亡途徑，后者只介導死亡受體途徑，從而產生較低的細胞凋亡率。這只是本文給出的一個猜想，至于不同脈寬納秒脈沖是否介導不同途徑的細胞凋亡，仍需進一步深入研究。

在仿真計算中發現50 ns脈沖作用產生最大的微孔密度，從而使得細胞膜電導率變化最大，這也與以往研究中隨脈寬降低微孔數量不斷增加相吻合[22]；由于本文仿真研究中未考慮微孔孔徑變化，實際上50 ns脈沖作用產生的微孔孔徑比較小，不能有效介導死亡受體凋亡途徑。

本研究只是對脈寬這一參數進行了量效關系研究，實際上納秒脈沖參數包括場強、脈寬、頻率及脈沖個數等，另外對于不同的細胞類型及狀態，相應的量效關系是否發生改變及如何變化仍需要進一步深入研究。脈沖參數發生變化除了帶來細胞效應的改變外，有可能引發新的生物電效應[29]，如PAKHOMOVA等[30]發現細胞在分串納秒脈沖處理后表現出超級敏感性，都是值得深入研究的內容。在本文的仿真計算中采用的細胞幾何參數和電磁參數均來自以往文獻，與實驗中SKOV3細胞實際參數存在較大差別，導致二者在比對時出現差異。

綜上所述，本文從脈寬參數角度研究納秒脈沖參數與細胞生物電效應間的量效關系，能夠在一定程度上為納秒脈沖樣機研制及后續臨床前實驗提供重要的理論依據和參數指導，具有重要的工程價值。

本文通過細胞實驗和仿真計算研究了納秒脈沖脈寬參數與細胞凋亡之間的量效關系，實驗結果和仿真結論均表明二者之間存在一定的窗口效應，即某一特定脈寬的脈沖(100 ns)同時靶向細胞膜和細胞器膜，可能通過死亡受體和線粒體凋亡途徑誘導細胞最大程度凋亡，且伴隨較小的細胞壞死率，這在臨床腫瘤治療中具有重要的意義。本研究結果能夠為臨床樣機研制及后續臨床實驗提供重要的理論支撐和參數指導。