微小RNA-195與急性胰腺炎進展的相關性研究

安超 朱代生 張鵬飛 張麗娜 金珂

（漯河醫學高等專科學校第二附屬醫院消化內科，河南 漯河 462300）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是臨床上最常見的急性腹部疾病之一，通常由膽石癥、酒精中毒和高脂血癥引起[1]。盡管國內外學者對AP的發病機制已有一些共識，但仍然缺乏有效的診斷和治療策略。在重癥急性胰腺炎病例中，炎性細胞因子的釋放可引起全身性炎性反應綜合征，并與器官功能障礙有關，其中多器官功能衰竭是導致患者死亡的主要原因，在急性胰腺炎患者中發生率占10%至15%。急性胰腺炎的初始病理變化是胰腺內胰蛋白酶的失控導致胰腺腺泡細胞損傷，誘發炎癥細胞和細胞因子的積累[2]。

MicroRNA（miRNA）是一類短的非編碼RNA，對調節細胞增殖、凋亡、壞死和炎癥起著關鍵作用。研究表明，循環中miRNA表達水平與胰腺腺泡細胞損傷和預后密切相關[3]。miR-195位于染色體17p13.1上，是microRNA-15/16/195/424/497家族的一員，能調節增殖、凋亡和炎癥等各種病理生理過程[4]。而對于miR-195在急性胰腺炎的發生、進展中的作用研究甚少，本研究重點分析miR-195與急性胰腺炎進展相關性，為急性胰腺炎的發生、進展提供新的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2019年12月在我院接受治療的62例AP患者，納入標準：年齡在18至65歲之間；符合AP診斷標準。AP診斷標準：急性突然持續性上腹痛、腹脹，腹部觸診壓痛陽性；經上腹部CT檢查呈現AP影像學改變。排除標準：癌癥患者；孕婦；精神病患者或拒絕合作的患者；放棄治療，轉院或死亡的患者。62例AP患者依據患者的嚴重程度分為兩組，輕度患者30例（輕度組），其中男16例，女14例；年齡26-78歲，平均年齡45.26±13.22歲；中重度患者32例（中/重度組），其中男18例，女14例；年齡26-77歲，平均年齡45.26±13.22歲。選擇20例同期進行體檢的健康志愿者作為對照組，其中男12例，女8例，年齡25-77歲，平均年齡45.57±13.14歲；三組成員的性別、年齡等一般資料無統計學差異（P>0.05）。本研究在患者入院后均告知并簽署知情同意書，并經院倫理委員會批準。

1.2 急性胰腺炎CT分級

A級：胰腺邊界清晰，血淀粉酶輕度升高；B級：胰腺頭、體、尾部局限性腫大或胰腺體積彌漫性腫大，血尿淀粉酶中度升高；C級：胰腺實質形態及密度異常伴有胰腺周圍脂肪炎性改變，血尿淀粉酶明顯升高；D級：胰腺周圍多個間隙出現積液，血尿淀粉酶趨向下降；E級：胰腺周圍多個間隙中2個或2個胰腺間隙積液，胰腺實質或胰周膿腫形成，血尿淀粉酶下降明顯。其中A-C級為輕度胰腺炎，D、E級為重度胰腺炎[5]。

1.3 qRT-PCR檢測血清中miR-195水平

患者及志愿者入院當日，采集空腹外周靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min，3000 rpm離心15 min，取血清，-80℃凍存。Trizol法提取總RNA，并測定RNA的純度。RT逆轉錄試劑盒反轉錄生成cDNA后，加入BeyoFast? SYBR Green qPCR Mix等進行PCR擴增，以U6為內參。miR-195上游序列：5′-AGCTTCCCTGGCTCTAG CA-3′；miR-195下 游 序 列：5′-CTGGAGCAGCA CAGCCAATA-3′。產物大小76 bp。內參U6上游引物：5′-GA CAGTCAGCCGCATCTTCT-3′，下游引物：5′-GC GCCC AATACGACCAAATC-3′，長度228bp。反應條件：95℃ 2min預變性，95℃ 15s變性，60℃ 30 s退火延伸，72℃延伸30 s，共40個循環。采用2-△△Ct法分析miR-195相對表達量。

1.4 MCTSI評分、BISAP評分、Ranson評分和APACHEII評分

所有患者入院后即進行改良的CT嚴重指數（Modified CT severity index，MCTSI）評分、急性胰腺炎嚴重程度床邊指數（Beside index of severity in acute pancreatitis，BISAP）評分、Ranson評分，急性生理與慢性健康評分 II（Acute physiology and chronic health evaluation，APACHEII）。其中MCTSI分為3級，I級：0-2分；II級：4-6分；III級：8-10分；BISAP評分<3分為輕癥急性胰腺炎，≧3分為中重癥急性胰腺炎；Ranson 評分<3分為輕癥急性胰腺炎，≧3分為重癥急性胰腺炎；APACHEⅡ評分評分<8分為輕癥急性胰腺炎，≧8分為重癥急性胰腺炎。

1.5 統計學分析

采用SPSS19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q法，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數（%）表示，分析采用X2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清miR-195水平

中/重度組miR-195為8.03±2.02，輕度組為4.32±1.27，對照組為1.52±0.76，中/重度組和輕度組患者血清miR-195相對表達水平明顯高于對照組，且中/重度組血清miR-195水平明顯高于輕度組血清（F=32.267，P<0.05），見圖1。

圖1 血清miR-195表達水平

2.2 血清miR-195與患者臨床特征的關系

血清miR-195與MCTSI評分、BISAP評分、Ranson評分、APACHEII存在相關性（P<0.05），而與性別、年齡無相關性（P>0.05），見表1。

2.3 miR-195診斷AP的ROC曲線下面積

miR-195診斷AP的ROC曲線下面積為0.881，診斷AP的準確性較好。截斷值為4.08，靈敏度為91.7%，特異度為86.2%，見圖2。

3 討論

AP是一種常見的臨床疾病，近年來其發病率一直在上升。它是由胰腺酶活化失調引起的急性炎癥反應引起的，還可引發其他一系列并發癥的產生，并出現多器官功能障礙[6]。AP患者可能伴有惡心、嘔吐和疼痛等各種臨床癥狀，易誤診為 消化不良。目前，AP的發病機制仍不明確。

表1 血清 miR-195與患者臨床特征的關系

圖2 miR-195診斷AP的ROC曲線下面積

MicroRNA（miRNA）是內源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的互補位點結合以進行切割（完美匹配）或翻譯抑制（不完美的目標雙鏈體）而在機體中發揮重要作用，主要參與生理和病理條件下多種細胞類型的調節，例如發育、增殖、凋亡、新陳代謝以及疾病[7]。近年來研究主要集中在胰腺癌中miRNA的表達，而關于miRNA在AP發生中的作用研究很少。miR-195屬于一種多功能miRNA，研究顯示miR-195在糖尿病患者玻璃體、視網膜組織中被上調并參與氧化應激誘導的視網膜內皮細胞損傷[8]。

本文采用qRT-PCR技術分析AP患者及志愿者血清miR-195水平。顯示，AP患者血清miR-195水平明顯高于對照組，而中/重度組明顯高于輕度組，說明miR-195參與了AP的發生和進展。而且miR-195與MCTSI評分、BISAP評分、Ranson評分、APACHEII密切相關，進一步證明miR-195水平與患者的疾病的嚴重程度存在一定的相關性，并可能成為判斷AP嚴重程度的預測性生物標記物。而且通過計算miR-195診斷AP的ROC曲線下面積發現其AUC值介于0.7-0.9之間，診斷準確性較好，并具有較高的靈敏度和特異度。

綜上所述，miR-195參與了AP的發生和發展，其水平能反應AP患者的嚴重程度，可以作為診斷AP嚴重程度的標記物，值得臨床推廣。