新型冠狀病毒血清特異性抗體不同檢測方法的臨床應(yīng)用評價

張俊華，李富榮，楊文貴，王進(jìn)云，金哲宇，馬瑛龍，任 崢，樸文花

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)，早期診斷并及時管控是阻止疫情進(jìn)一步播散和控制新感染線索的關(guān)鍵[1]，因此，及時篩查并確診感染仍是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室檢測面臨的首要任務(wù)。核酸檢測陽性是疑似患者確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其對實(shí)驗(yàn)場地及操作人員均有較高要求，而且檢測結(jié)果易受標(biāo)本質(zhì)量、病毒感染部位及表達(dá)量等眾多因素影響，新冠病毒血清學(xué)抗體檢測可在一定程度上彌補(bǔ)核酸檢測對于檢測條件要求較高的局限性[2-3]，對于疫情防控來說，可為核酸檢測提供一個重要的補(bǔ)充協(xié)同手段，在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第七版)》中，抗體檢測已經(jīng)被納入確診方法之一[ 4]。本實(shí)驗(yàn)旨在補(bǔ)充研究血清學(xué)抗體檢測在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的方法學(xué)差異，分別利用血清學(xué)抗體的膠體金免疫層析法(GICA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光法( CLIA)檢測新型冠狀病毒血清學(xué)特異性抗體，為實(shí)驗(yàn)室檢測新型冠狀病毒肺炎提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究采集了寧夏回族自治區(qū)21例核酸檢測陽性的COVID-19確診病例(2020年2月10日-3月12日收治)26份血清標(biāo)本，21個病例中有5個病例采集了不同時期的雙份血清標(biāo)本，血清收集時間最早為發(fā)病后第22天，最晚為發(fā)病后第53天。此外還補(bǔ)充檢測了16例康復(fù)隨訪患者，病例年齡范圍為7～67歲，平均年齡35歲，其中男性7例，女性9例。陰性血清標(biāo)本來自寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院及寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院篩查的排除新冠肺炎患者為對照組，共計(jì)30份，確診及對照標(biāo)本參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第七版)》。

1.2 試劑與方法

1.2 1 試劑：①膠體金免疫層析法檢測試劑：A為國產(chǎn)某品牌新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體膠體金法檢測試劑盒，包括兩類檢測試劑，其中A1試劑為新型冠狀病毒(2019-nCoV)IgM抗體膠體金法檢測試劑,批號為20200205，有效期至2020/11/04；A2試劑為新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體IgG膠體金檢測試劑,批號為20200208，有效期至2020/11/09。B為國產(chǎn)某品牌新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體(IgG/IgM)膠體金法檢測試劑，批號為W19500304,有效期至2020/10/04；C為國產(chǎn)某品牌新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體(IgG/IgM)膠體金法檢測試劑，批號為2005120410，有效期至2020/11/02。②酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑：D為國產(chǎn)某品牌新型冠狀病毒(2019-nCoV)(IgG/IgM)抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑，批號為20200205，有效期至2021/2/20。③化學(xué)發(fā)光法檢測試劑：E為新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法)，注冊證號20203400198，批號20200521，有效期至2020/11/4。不同試劑基本特征見表1。

表1 不同檢測試劑性能特征

1.2.2 膠體金免疫層析法：嚴(yán)格按照試劑使用說明書操作，肉眼觀察顯示結(jié)果判定。判讀陽性：在檢測區(qū)及質(zhì)控區(qū)各出現(xiàn) 1 條反應(yīng)線；判讀陰性：僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)1條反應(yīng)線；判讀無效：質(zhì)控區(qū)無反應(yīng)線出現(xiàn)，或僅在檢測區(qū)出現(xiàn)1條反應(yīng)線，表明檢測無效。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法：操作嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行，設(shè)定酶標(biāo)儀于450/630 nm處用空白孔調(diào)零，測定各孔吸光光度(OD)值。結(jié)果判定：臨界值(cut off)=陰性對照平均OD值×2.1(陰性對照孔值低于0.05者按0.05計(jì)算)，陰性對照孔OD值<0.10，陽性對照孔OD值>0.80，否則試驗(yàn)無效。陽性判定：樣品OD值≥臨界值(cut off)者為2019-nCov抗體陽性；樣品OD值<臨界值(cut off)者為2019-nCov抗體陰性。

1.2.4 化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法：運(yùn)用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法測定，加入預(yù)激發(fā)液與激發(fā)液后測量產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)信號，以相對發(fā)光單位(RLU)表示。樣本中存在的2019-nCoV抗體量與系統(tǒng)檢測的RLU成正比。樣本S/CO≥1.0時，視為對2019-nCoV抗體呈反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)操作步驟均按說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.3 主要儀器：酶標(biāo)儀(鄭州安圖全自動酶標(biāo)分析儀)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同檢測方法診斷的準(zhǔn)確性采用敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、漏診率、誤診率、約登指數(shù)進(jìn)行描述。

2 結(jié)果

2.1 不同試劑盒檢測血清學(xué)抗體結(jié)果：采用不同檢測方法的六種試劑盒(A1、A2、B、C、D、E)檢測56例血清樣本，其中四種GICA法檢測試劑(A1、A2、B、C)敏感性為69.2%～80.7%；特異性為96.7%～100.0%；陽性預(yù)測值95.2%～100.0%，陰性預(yù)測值為78.9%～85.7%；漏診率和誤診率分別為19.2%～30.8%和0.0%～3.3%，約登指數(shù)為0.69～0.81；ELISA及CLIA檢測試劑(D、E)敏感性分別為92.3%和96.2%，特異性及陽性預(yù)測值可達(dá)到100.0%，陰性預(yù)測值分別是93.8%和96.8%，漏診率分別為7.7%和3.9%，誤診率為0.0%，約登指數(shù)分別為0.92和0.96。不同試劑盒檢測能力評價表，見表2。

表2 不同試劑盒檢測血清學(xué)抗體的能力評價

2.2 16例康復(fù)期患者血清IgM和IgG抗體陽性率比較：16例血清標(biāo)本中16號、18號標(biāo)本IgM和IgG抗體均為陰性，13號、22號、25號、26號標(biāo)本檢測結(jié)果為IgM(+)IgG(-)，19號標(biāo)本檢測結(jié)果為IgM(-)IgG(+)，其余9例標(biāo)本(距發(fā)病時間26～37 d)檢測IgM和IgG抗體結(jié)果均為陽性，見表3。

2.3 三種檢測方法靈敏度比較：CLIA檢測血清按1∶512倍稀釋時，檢測仍為陽性(1號、3號、4號、5號標(biāo)本)，而ELISA檢測陽性最大稀釋倍數(shù)為1∶256(5號標(biāo)本)，GICA檢測陽性最大稀釋倍數(shù)為1∶128(2號標(biāo)本)，5例標(biāo)本陽性檢出率隨樣本稀釋滴度的增加而降低，化學(xué)發(fā)光法檢測2019-nCoV總抗體靈敏度高于其他兩種方法，酶聯(lián)免疫吸附法次之，見表4。

表3 16例康復(fù)期患者血清IgM和IgG抗體陽性率比較

表4 3種方法學(xué)檢測試劑C/D/E對5例陽性標(biāo)本梯度稀釋結(jié)果

3 討論

核酸檢測作為COVID-19確診標(biāo)準(zhǔn)，具有靈敏度高、特異度好、可早期診斷等優(yōu)點(diǎn)[5]，但相關(guān)研究表明，新型冠狀病毒核酸檢測對于確診陽性病例的檢出率僅為30%～50%[6]，血清特異性抗體檢測可以滿足對疑似病例快速篩查的要求，是實(shí)驗(yàn)室診斷的重要手段。抗體的檢測對于病毒確診及感染時間、評估病毒的感染階段并預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸具有重要意義[7-8]。

本研究分別利用GICA、ELISA、CLIA三種檢測方法對2019-nCoV病毒血清特異性抗體進(jìn)行檢測，比較6種試劑盒對COVID 19 患者的抗體陽性檢出率差異，其中ELISA與CLIA診斷試劑準(zhǔn)確性較高。在GICA檢測試劑中，總抗體檢測的約登指數(shù)高于單獨(dú)檢測IgM和 IgG，在各項(xiàng)評價指標(biāo)中的結(jié)果高于IgM和IgG檢測試劑盒，在臨床使用GICA試劑的過程中，建議使用總抗體檢測試劑或?qū)gG與IgM抗體聯(lián)合檢測，以保證靈敏度和特異性，降低因假陽性和假陰性帶來的漏診和誤診[9]。

同時，在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)金標(biāo)法試劑檢測靈敏度低于其他檢測方法，會有漏檢和誤檢現(xiàn)象，建議多種檢測方法聯(lián)合使用。膠體金法檢測試劑中，針對新冠病毒抗體IgM和IgG，聯(lián)合檢測相比抗體IgM的單項(xiàng)檢測更具優(yōu)勢，可對新冠肺炎患者疾病發(fā)展過程的不同階段進(jìn)行全覆蓋，從不同維度完善對新冠病毒肺炎疑似患者的輔助診斷，在一定程度上提高患者的陽性檢出率[10]。

通常病原體感染機(jī)體后產(chǎn)生的特異性IgG抗體晚于IgM抗體，新冠病毒感染者特異性IgG抗體在發(fā)病后第1周的陽性率較低(3.7%～42.9%)，第2周的陽性率逐漸上升到43.5%～76.0%[11]。但也有研究報告，特異性IgG抗體陽性率在第2周能達(dá)到90.0%以上。新冠病毒特異性IgG抗體水平在發(fā)病后第3～4周迅速上升并達(dá)到峰值，陽性率為80.0%～100.0%，在第5～7周特異性IgG抗體陽性率可維持在100.0%[12-13]。GICA相同品牌試劑盒分別檢測16例康復(fù)隨訪患者IgM和IgG抗體，病例距發(fā)病時間23～37 d (3～5周)，2019-nCoV IgM抗體有14例陽性，2例陰性患者不排除IgM抗體水平下降所致，2019-nCoV IgG抗體檢測10例陽性，4例陰性，分析抗體檢測差異和假陰性可能與試劑盒本身檢測差異有關(guān)，也可能與病毒的感染機(jī)制有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

通過5例陽性血清的梯度稀釋實(shí)驗(yàn)，CLIA結(jié)合了高靈敏的化學(xué)發(fā)光測定方法與高特異的抗原抗體反應(yīng)，其敏感性上高于ELISA及GICA兩種方法。此外，不同新冠患者抗體滴度水平差異表明個體感染病毒狀況不同或機(jī)體免疫應(yīng)答存在差異，在康復(fù)患者血漿用于治療前進(jìn)行抗體滴度的檢測以保證療效是非常必要的。

本研究僅為初步探索，客觀原因?qū)е螺^少的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量使得納入病例數(shù)較少，且樣本連續(xù)性不足，研究采用的部分膠體金法和ELISA法試劑均為用于科學(xué)研究的試劑，而不是用于病例診斷，因此可能存在試劑質(zhì)量問題導(dǎo)致假陰性或假陽性。同時，新型冠狀病毒對于其血清中抗體產(chǎn)生時間及其消長規(guī)律還處于探索研究階段，在疫情防控過程中，仍然需要大量的抗體檢測數(shù)據(jù)以推動病毒的流行病學(xué)調(diào)查。因此血清學(xué)抗體檢測暫時不能作為新冠肺炎確診和排除的唯一依據(jù)，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心張瑞等從新型冠狀病毒特異抗體檢測的假陽性角度出發(fā)，認(rèn)為特異性IgM/IgG抗體檢測不適用復(fù)工等一般人群的篩查[14]，血清學(xué)抗體檢測可以作為核酸檢測陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測指標(biāo)，通過核酸、抗體檢測聯(lián)合應(yīng)用，可以縮短檢測窗口期，提高陽性檢出率，有利于病例的發(fā)現(xiàn)、診斷以及疫情的防控。