多重處理對華重樓種子休眠解除的影響

譚秋生，章文偉，徐 廣，鄧才富，任星宇，羅 敏，楊永東，羅 川

(重慶市藥物種植研究所 中藥材質量控制研究中心，重慶 408435)

全世界共有24種重樓植物品種，我國有19種[1]。云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.和七葉一枝花(華重樓)ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara為名貴中藥材重樓的正品來源[2]。因其生長緩慢，自種子育苗到藥材采收至少需要7～10年，加上種植技術薄弱、市場需求量大等原因，供需矛盾十分突出，不僅價格攀高，野生資源也遭受掠奪式采挖，面臨枯竭。人工種植是緩解供需矛盾和保護野生資源的重要途徑，種子育苗更是大面積種植的重要種苗來源，因其具有品種易控、繁育量大和成本較低等優點。

采取合理措施打破休眠是重樓種子快速育苗的關鍵。重樓植物在果實成熟時種子的胚發育不全，胚芽、胚軸、胚根和子葉都還未形成，外加胚乳堅硬、內種皮表層角質化等原因，其種子存在形態后熟和生理休眠特性，需要經過胚的形態建成和種子內源抑制物解除兩個過程才能萌發[3-6]。研究表明，滇重樓種子內種皮與胚乳不存在吸水障礙[7-8]，外種皮及胚乳均含有抑制種子萌發及幼苗生長的物質，胚乳抑制作用強于外種皮[8-10]，種子種胚休眠解除是抑制物質(ABA)減少與促萌物質(GA3)增加和積累的結果[11]。

赤霉素(GA3)是重樓種子休眠解除研究最常用的一種激素，效果也較好，可能與影響種子中α、β淀粉酶加速淀粉降解促進可溶性糖積累有關[12]，浸種濃度一般50～500 mg·L-1。10%硫酸浸泡重樓種子可軟化內種皮，提高萌發率[13]。合適的超聲波處理可縮短重樓種子萌發時間，提高發芽率和發芽指數[14-15]。目前，未見稀硫酸、GA3和超聲波三者聯合處理對重樓種子休眠解除的相關報道。本試驗采用10%硫酸首浸+超聲+ GA3再浸模式強化華重樓種子層積前處理，恒溫沙藏后定期觀察種子萌發情況，對各種處理后的休眠破除效果進行評價，篩選最佳處理組合，為華重樓種子快速育苗提供技術支持。

1 材料與試劑

1.1 儀器

AL-104電子天平(梅特勒-托利多儀器公司)；LRHS-150-Ⅱ恒溫恒濕培養箱(上海龍躍儀器設備有限公司)；KQ3200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TW12通用水浴槽(德國JULABO)；240 mL組培玻璃瓶。

1.2 試劑

95%赤霉素(GA3，河南新雨化工科技有限公司)；50%多菌靈可濕性粉劑(四川潤爾科技有限公司)；硫酸、無水乙醇、氯化汞(分析純)；純水，實驗室自制。

1.3 材料

試驗種子于2018年10月29日購買自四川省萬源市玉帶鄉曹家山村，經本單位章文偉副研究員鑒定為七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara的帶新鮮紅色外種皮種子。試驗前，種子加水40 ℃浸泡48 h，然后在不銹鋼篩網上，反復用手搓揉種子和加水清洗，除凈紅色外種皮，得白色凈種子，以下簡稱白籽，陰干，過圓孔篩(Φ3 mm)，收集篩面上表面光亮、子粒飽滿種子，備用。

2 方法

2.1 種子準備

備足50 mL小燒杯，每杯隨機計量數入100粒白籽，每種處理設置3個重復。

2.2 首浸

除對照(CK)外，每杯加入10%硫酸20 mL，分別室溫浸泡10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，倒出硫酸廢液，種子加水2次透洗。

2.3 超聲

包括對照(CK)，每杯加水30 mL，置超聲波清洗器中，保持水溫40 ℃，超聲(150 W、40 kHz)50 min，倒出種子瀝干后裝回原杯。

2.4 再浸

除對照(CK)用純水外，每杯加入100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1和500 mg·L-1GA3溶液20 mL，用保鮮膜封口，置于水浴槽中25 ℃、避光浸泡24 h，倒出赤霉素廢液，種子加水2次透洗后倒出瀝干。

2.5 層積濕沙制備

干河沙過篩，收集直徑0.5 mm下的細沙粒，130 ℃干熱滅菌4 h，冷卻后，加入沙量2%的50%多菌靈粉劑，拌勻，按30%～40%含水量加水，攪勻。河沙濕度控制在“手握成團，輕捏即散”的狀態，即可。

2.6 裝瓶和沙藏

取上述復合處理后的干白籽，用75%酒精浸泡1 min、再用0.15% HgCl2浸泡10 min，純水透洗3次，瀝干后，與50 g濕沙拌勻后裝入玻璃組培瓶中，確認種子都被沙覆蓋后，旋緊蓋子，放入20 ℃培養箱避光培養。

2.7 數據統計與分析

本研究將種子露白，胚根突破種皮1 mm視為萌發。試驗4個月，分別于54 d、82 d和110 d共3次對沙藏種子進行集中觀察，選出已萌發種子，清除腐爛種子，按萌發率(%)=萌發種子累計數/試驗種子數×100%計算各期萌發率，數據經Microsoft Excel 2010處理后用SPSS 21.0軟件進行方差分析，兩兩比較采用S-N-K檢驗。

3 結果與分析

3.1 不同濃度GA3浸種對華重樓種子萌發的影響

華重樓白籽直接加水超聲后再用不同濃度GA3浸泡后沙藏，各期萌發率見表1。先后3次觀察，均以400 mg·L-1GA3(簡稱N400，下同)組最佳，萌發率最高，分別為39.00%、41.00%和80.00%，與其他濃度組均有顯著差異。前兩次，只有N400超過CK，分別超出1.33%、9.33%，差異較?。坏?次，N400和N100均超過CK，分別超過45.33%、30.66%，差異較大。赤霉素浸泡對華重樓種子休眠解除有一定作用，但無明顯影響規律。試驗表明，華重樓種子超聲+GA3浸泡模式中，最佳GA3濃度為400 mg·L-1，其次為100 mg·L-1，種子萌發速度及萌發率均較高，萌發率分別為80.00%和65.33%。

表1 華重樓種子不同濃度GA3浸泡后萌發率

3.2 10%硫酸不同時間浸種對華重樓種子萌發的影響

華重樓白籽用10%硫酸浸泡不同時間后再加水超聲后沙藏，各期萌發率見表2。先后3次過程觀察，均以50 min(簡稱M50，下同)組最佳，萌發率最高，分別為40.00%、77.33%和85.33%。第1次，僅有M50超出CK 12.33%，M40與CK相近；第2次，M20、M40和M50分別超出CK 28.33%、33.66%和45.66%；第3次，M10、M20、M40和M50分別超出CK 27.33%、30%、46.33%和50.66%。第1、2次，M50與其他時間組均有顯著差異；第3次，M50與除M40外的時間組有顯著差異。10%硫酸浸泡對華重樓種子休眠解除有一定作用，但也無明顯影響規律。試驗表明，華重樓種子10%硫酸浸泡+超聲模式中，最佳浸泡時間為50 min，其次為40 min，種子萌發速度及萌發率均較高，萌發率可達到80.00%以上。

表2 華重樓種子用10%硫酸浸泡不同時間萌發率

3.3 10%硫酸、超聲波與GA3聯合處理對華重樓種子萌發的影響

華重樓白籽經10%硫酸不同時間浸泡、超聲和不同濃度赤霉素(GA3)浸泡后沙藏，第3次(110 d)種子萌發率見表3。僅有M10+超聲+N400萌發率超過90.00%；萌發率80%～90%有6組，分別為M20+超聲+N400、M40+超聲+N400、M40+超聲+N300、M10+超聲+N100、M40+超聲+N100和M30+超聲+N400。三組最差，萌發率<10%，分別為M10+超聲+N200、M20+超聲+N100和M20+超聲+N300。表明10%硫酸+超聲+GA3模式可有效解除華重樓種子休眠，提高萌發率，最佳組合為M10+超聲+N400，其次為M30+超聲+N400。GA3濃度、10%硫酸浸泡時間分別以400 mg·L-1和40 min為宜。

表3 不同組合處理后沙藏種子萌發率

方差分析結果(表4)顯示：10%硫酸(min)，F=171.834，P<0.01，差異極顯著；GA3(mg·L-1)，F=442.240，P<0.01，差異極顯著；10%硫酸(min)*GA3(mg·L-1)，F=160.915，P<0.01，差異極顯著。表明去除紅外種皮華重樓種子層積前處理時10%硫酸浸泡時間和GA3濃度對其休眠解除后萌發影響都極顯著。10%硫酸浸泡40 min、50 min效果較好，與CK、浸泡10 min、20 min和30 mim均有顯著差異(表5)；GA3浸泡以400 mg·L-1濃度最佳，與其他濃度組有顯著差異(表6)。相關性分析結果(表7)表明10%硫酸浸泡時間與種子萌發率呈極顯著正相關，GA3浸泡濃度與種子萌發率呈負相關，影響不顯著。

表4 10%硫酸聯合GA3浸泡后萌發率的方差分析結果

表5 10%硫酸不同時間浸泡萌發率均數的兩兩比較 (S-N-K法)

表6 不同濃度GA3浸泡萌發率均數的兩兩比較 (S-N-K法)

表7 10%硫酸浸種時間與GA3浸種濃度對種子萌發率的相關性分析

4 討論

相同超聲條件下，10%硫酸或GA3浸泡對華重樓種子休眠解除、促進萌發均有一定作用，但無明確影響規律。單因素考察，10%硫酸最佳浸泡時間為50 min、其次為40 min，GA3浸泡最佳濃度為400 mg·L-1，萌發率均可達到80%及以上。10%硫酸、超聲和GA3聯合處理，6種組合種子萌發率均可達80%以上，以10%硫酸10 min+超聲+400 mg·L-1GA3組合萌發效果最好，萌發率高達96.67%。10%硫酸浸泡時間和GA3濃度對去皮華重樓種子萌發都有極顯著影響，10%硫酸浸泡時間與萌發率呈極顯著正相關，GA3濃度與萌發率呈負相關，但影響不顯著。本試驗只對20 ℃恒溫層積效果進行了評價，文獻多主張高低變溫層積，通過這種強化前處理的組合措施，變溫試驗是否會取得更好效果，還有待進一步研究。

本研究主要考慮到重樓種子具有內種皮表層角質化、胚乳堅硬且含萌發抑制物等特點，在現有文獻[13，16-17]的基礎上，以強化前期處理盡量縮短種子層積時間為目標，分別選用10%硫酸浸種軟化種皮提高種子透水性、40 ℃超聲(150 W、40 kHz)50 min置換種子抑制萌發物和赤霉素溶液25 ℃再浸種24 h增加促萌物質。試驗用華重樓白籽百粒重4.5 g左右，其生活力采用0.1%TTC染色法[18]測定為92.0%。

項目組還對GA3拌濕河沙層積效果進行了考察，具體方法為華重樓白籽10%硫酸浸泡20 min+超聲+水浸泡處理后埋藏于不同濃度GA3拌濕河沙中層積。結果表明，隨GA3濃度增加對華重樓種子萌發表現一定抑制作用，最宜100 mg·L-1，萌發率90.53%；相同濃度GA3，拌濕河沙層積效果優于再浸種。原因可能有二：①用水替換GA3再浸種可置換出更多抑萌物質；②GA3拌沙，沙中GA3含量較高和殘留更持久，種子長時間被GA3包圍，作用更充分，從而影響其萌發。赤霉素拌沙層積技術對后續種子發芽出苗及生長有何影響，以及是否適合推廣都還有待進一步研究。