通脈降濁解毒方對缺血性腦卒中大鼠皮質(zhì)神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43表達(dá)的影響研究

李九席，焦紅軍，任 明

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

缺血性腦卒中是指由局部腦組織血液循環(huán)障礙引起的腦組織供氧、供血障礙，導(dǎo)致的局部腦組織崩解壞死情況[1]。患者軸突往往不能有效再生，導(dǎo)致患者發(fā)病后常出現(xiàn)吞咽、語言、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)等功能障礙[2]。積極有效的治療措施對改善患者受損腦組織功能、提高患者生活質(zhì)量具有積極意義。臨床上通常通過藥物治療及康復(fù)訓(xùn)練方式促進(jìn)患者腦功能恢復(fù)，通過給予藥物治療或其他刺激加強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)的修復(fù)，并抑制誘導(dǎo)突觸與神經(jīng)元胞體死亡的不良因素，從而促進(jìn)患者腦功能重塑[3]。研究指出，微環(huán)境對神經(jīng)功能的修復(fù)會(huì)產(chǎn)生重要影響[4]。神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)是神經(jīng)生長于神經(jīng)元發(fā)育的標(biāo)志蛋白，同時(shí)也是缺血性腦卒中病發(fā)后軸突生長的標(biāo)志物，通過觀察GAP-43的表達(dá)情況，可以對缺血性腦卒中的神經(jīng)修復(fù)過程進(jìn)行有效判斷和評估[5]。本研究旨在探討通脈降濁解毒方對缺血性腦卒中病灶周圍GAP-43表達(dá)水平的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量(250±20)g。購自凱學(xué)生物科技(上海)有限公司，許可證號：NO.0251284。在18～26 ℃室溫、自然光線環(huán)境下用無菌蒸餾水與飼料飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物 “通脈降濁解毒方”組方 陳皮、茯苓、丹參、白芍各20 g，黃芩、柴胡、枳實(shí)各15 g，半夏、大黃各10 g，甘草10 g。藥材均取自本院中藥房，加入8倍量水煎煮2次后過濾去除藥渣，制成相當(dāng)于原生藥2 g/mL的水煎液。

1.1.3 儀器與試劑 本次實(shí)驗(yàn)主要儀器及試劑信息見表1。

表1 主要儀器、試劑信息

1.2 缺血性腦卒中大鼠模型制備

將48只健康雄性SD大鼠分籠飼養(yǎng)1周，隨機(jī)將大鼠分為正常組、模型組、藥物低劑量組與高劑量組，每組各12只，每組又分為7 d與14 d亞組，各6只，之后采用熱凝閉大腦中動(dòng)脈法制備大鼠模型。首先腹腔注射水合氯醛(0.5 mL/100 g，6%)對大鼠進(jìn)行麻醉，將其右側(cè)在手術(shù)臺(tái)上固定，去除顳頂左側(cè)鼠毛，并用碘伏與乙醇對局部皮膚進(jìn)行消毒清潔。于大鼠左耳、左眼間將皮膚切開，進(jìn)行顳肌分離并使顳骨翼板充分暴露，注意避免對大鼠顳神經(jīng)造成損傷。采用牙科鉆自顳骨翼板通至硬腦膜，在動(dòng)物手術(shù)顯微鏡下找尋大鼠大腦動(dòng)脈。用小咬骨鉗去除大鼠部分顱骨，使大腦中動(dòng)脈近端充分暴露。采用電凝器對大腦動(dòng)脈(近端與大腦下靜脈段)進(jìn)行凝閉，正常組大鼠不用凝閉，之后對大鼠顳肌與皮膚進(jìn)行縫合。待大鼠蘇醒后用Longa評分法對大鼠模型質(zhì)量進(jìn)行評估，1～3分表示模型制備成功[6]。Longa評分標(biāo)準(zhǔn)：大鼠無神經(jīng)損傷表現(xiàn)，記為0分；大鼠手術(shù)對側(cè)前、后爪無法完全伸展，記為1分；大鼠行走時(shí)朝手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈，記為2分；大鼠行走時(shí)朝手術(shù)對側(cè)傾倒，記為3分；大鼠無法自行行走，記為4分。大鼠Longa評分越高，說明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.3 治療方法

對正常組及模型組大鼠采用0.9%NaCl注射液灌胃，劑量5 mL/kg，1次/d。低劑量組與高劑量組按照60 kg體重成人用藥量10倍、20倍的“通脈降濁解毒方”灌等量藥物，1次/d。對各組大鼠實(shí)施連續(xù)治療至造模后的第7天、14天，分別進(jìn)行平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)，之后處死大鼠，觀察各組大鼠病灶周圍GAP-43表達(dá)水平。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 運(yùn)動(dòng)功能檢測[7-8]在大鼠連續(xù)治療7 d、14 d后進(jìn)行平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)。平衡木行走實(shí)驗(yàn)：選取一條長170 cm、寬2 cm的木棒放置在離桌面7 cm處，讓大鼠在平衡木上行走，10 min/d。評分標(biāo)準(zhǔn)：大鼠成功穿過平衡木且未跌倒，記為0分；大鼠可以穿過平衡木，且跌倒概率<50%，記為1分；大鼠可以穿過平衡木，但跌倒概率>50%，記為2分；大鼠可以穿過平衡木，但癱瘓側(cè)后肢不能輔助移動(dòng)，記為3分；大鼠無法穿過平衡木，但可以坐在平衡木上，記為4分；大鼠無法穿過平衡木，坐在平衡木上會(huì)掉落，記為5分。每只大鼠平均進(jìn)行4～10次測試，根據(jù)大鼠的總跌倒次數(shù)判斷大鼠的跌倒概率。轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備一根長150 cm、d=4.5 cm的木棒，將其一端固定于轉(zhuǎn)動(dòng)器上，轉(zhuǎn)動(dòng)器轉(zhuǎn)速設(shè)置為3r/min，進(jìn)行左右交替式轉(zhuǎn)動(dòng)，大鼠在轉(zhuǎn)棒上進(jìn)行行走、旋轉(zhuǎn)、抓握等運(yùn)動(dòng)，10 min/d。評分標(biāo)準(zhǔn)：大鼠在木棒轉(zhuǎn)動(dòng)過程中可以行走，記為0分；在木棒轉(zhuǎn)動(dòng)過程中大鼠不會(huì)掉落，且能堅(jiān)持1 min以上，記為1分；木棒開始轉(zhuǎn)動(dòng)后大鼠會(huì)掉落，記為2分；木棒開始轉(zhuǎn)動(dòng)前大鼠就掉落，記為3分。

1.4.2 GAP-43表達(dá)水平檢測 各組大鼠在治療7 d、14 d后進(jìn)行GAP-43表達(dá)檢測，腹腔注射水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉(0.5 mL/100 g，6%)，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，心臟灌注4%多聚甲醛之后斷頭取腦。切取2 mm包含病灶的大鼠腦組織，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，并在常規(guī)濃度梯度乙醇中進(jìn)行脫水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡后用石蠟包埋，并進(jìn)行連續(xù)切片，取厚5 μm的切片，通過鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法檢測病灶周圍GAP-43的表達(dá)情況。切片常規(guī)脫蠟、水化，并按照試劑盒上的操作說明嚴(yán)格執(zhí)行各項(xiàng)操作過程。DAB顯色鏡檢，在400倍視野中選取5個(gè)不重疊的視野，采用尼康NIS-Elements D 3.0圖像獲取分析軟件測定陽性表達(dá)無的光密度積分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Longa評分比較

正常組大鼠由于未進(jìn)行大腦動(dòng)脈凝閉，神經(jīng)功能并未受損，故評分用“-”代替。模型組、低劑量組、高劑量組大鼠在治療7 d后，Longa評分分別為(2.82±0.63)分、(2.20±0.23)分、(1.48±0.13)分；治療14 d后，Longa評分分別為(2.51±0.44)分、(1.44±0.20)分、(0.81±0.22)分。各組間的同期評分結(jié)果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Longa評分越高，提示大腦的神經(jīng)功能受損情況越嚴(yán)重，觀察結(jié)果可知，3組大鼠在治療后Longa評分均有所上升，模型組采用生理鹽水灌胃，故考慮可能是腦組織正常區(qū)域搭建側(cè)支循環(huán)通過代償作用改善病灶部位的缺血、缺氧情況，但大鼠自身代償能力有限，故Longa評分變化幅度較小。低劑量組與高劑量組治療14 d的Longa評分明顯高于同組治療7 d時(shí)的評分結(jié)果，提示通脈降濁解毒方可以有效改善缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能，促進(jìn)大鼠腦功能重塑。且大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)情況與藥物濃度表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，高劑量藥物能夠更有效地促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。各組大鼠Longa評分比較見表2。

表2 各組大鼠Longa評分比較 分)

2.2 各組大鼠平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)評分比較

治療7 d時(shí)，高劑量組大鼠平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)評分均明顯低于模型組與低劑量組(P<0.05)，模型組與低劑量組比較均無明顯差異(P>0.05)；治療14 d時(shí)，低劑量組大鼠平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)評分均明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組大鼠平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)評分均明顯低于模型組與低劑量組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)評分越高說明大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)障礙越明顯，運(yùn)動(dòng)能力越差。觀察結(jié)果可知，3組大鼠在治療后運(yùn)動(dòng)功能均逐漸恢復(fù)，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)可能建立在自身出現(xiàn)側(cè)支代謝循環(huán)的基礎(chǔ)上，運(yùn)動(dòng)功能得到小幅度回升。低劑量組與高劑量組治療14 d的評分結(jié)果明顯高于同組治療7 d時(shí)的評分結(jié)果，說明通脈降濁解毒方可以有效促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，從而提高大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。且大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況與藥物濃度表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，高劑量藥物能夠更有效地促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。各組大鼠平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)評分比較見表3。

表3 各組大鼠平衡木行走實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)評分比較 分)

2.3 各組大鼠GAP-43蛋白光密度積分比較

觀察結(jié)果可知，GAP-43陽性表達(dá)在圖像中呈顆粒狀，治療7 d時(shí)低劑量組與高劑量組的圖像結(jié)果較為密集，光密度積分較高，分別為(85.92±9.20)分與(96.83±10.67)分，高劑量組GAP-43蛋白平均光密度積分明顯高于低劑量組。正常組與模型組的圖像結(jié)果相對分散，光密度積分分別為(22.09±3.30)分與(67.46±7.24)分。治療14 d后，正常組大鼠光密度積分為(22.06±3.32)分，較治療14 d時(shí)無明顯變化。其他3組積分較治療7 d時(shí)均發(fā)生回落，模型組、低劑量組、高劑量組積分分別為(61.10±6.85)分、(75.56±8.51)分、(82.23±9.38)分，3組間的同期比較結(jié)果均存在顯著差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組各時(shí)間段的光密度平均積分均為最高，提示通脈降濁解毒方可以有效刺激機(jī)體病灶周圍GAP-43蛋白表達(dá)，且其表達(dá)水平與藥物濃度表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性。詳見表4。

表4 各組大鼠GAP-43蛋白光密度積分比較 分)

圖1 各組大鼠7 d后GAP-43陽性表達(dá)(HE染色，×400)

圖2 各組大鼠14 d后GAP-43陽性表達(dá)(HE染色，×400)

3 結(jié)果

缺血性腦卒中是指大腦血管出現(xiàn)閉塞或狹窄導(dǎo)致局部腦組織血流灌注障礙，導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)缺血、缺氧性損傷。大腦出現(xiàn)缺血性腦卒中后，谷氨酸會(huì)在細(xì)胞間隙堆積，局部病灶區(qū)域由于缺血、缺氧及炎癥反應(yīng)會(huì)引發(fā)機(jī)體代謝功能紊亂，機(jī)體產(chǎn)生與清除自由基的代謝平衡被打破，導(dǎo)致患者出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷[9]。具體表現(xiàn)為患者腦細(xì)胞壞死、神經(jīng)功能與腦組織受損、出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙并伴隨各種炎癥反應(yīng)等[10]。通常出現(xiàn)缺血性腦卒中時(shí)，機(jī)體會(huì)通過構(gòu)建側(cè)支代謝循環(huán)的方式改善缺血腦組織的腦神經(jīng)功能。但機(jī)體自身的代償能力是有限的，往往難以有效改善疾病癥狀。不良的內(nèi)環(huán)境(如炎性環(huán)境)及低下的神經(jīng)元再生能力都是造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷后預(yù)后不良的主要原因[11]。當(dāng)前臨床研究結(jié)果表明[12]，抑制性蛋白異常表達(dá)、促生長因子水平低下、營養(yǎng)因子缺乏、膠質(zhì)瘢痕的產(chǎn)生均會(huì)對神經(jīng)功能的修復(fù)造成不良影響。

GAP-43是神經(jīng)組織的特異性磷酸蛋白，在發(fā)育或再生的軸突生長錐末端高表達(dá)[13]。其能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化與軸突生長的作用，并能參與受損神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)與腦功能重塑過程，具有促進(jìn)軸突再生、神經(jīng)細(xì)胞生長與突觸重建的能力。GAP-43作為軸突生長的分子標(biāo)志蛋白，在缺血性腦卒中病灶周圍通常會(huì)呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)。通常情況下，在出現(xiàn)缺血性腦卒中后，GAP-43的表達(dá)水平就會(huì)立即上升，在7 d時(shí)到達(dá)峰值。隨著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟，其表達(dá)水平會(huì)逐漸回落[14]。中藥治療可以通過調(diào)節(jié)GAP-43的表達(dá)水平，改善病灶周圍微環(huán)境，從而有效促進(jìn)受損腦組織的神經(jīng)功能修復(fù)與腦功能重塑[15]。

中醫(yī)學(xué)將缺血性腦卒中歸于“中風(fēng)”范疇，認(rèn)為其病機(jī)在于痰瘀互結(jié)、阻于腦竅，痰濁、肝風(fēng)、瘀血阻竅導(dǎo)致神不導(dǎo)氣、竅閉神匿，需治以清熱解毒、通脈降濁之方[16]。本次研究選用“通脈降濁解毒方”，其中陳皮理氣健脾、燥濕化痰，茯苓健脾寧心、利水滲濕，活血通經(jīng)、祛瘀止痛，白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、平肝止痛，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，柴胡和解表里、疏肝升陽，枳實(shí)破氣消積、化痰散瘀，半夏燥濕化痰、消痞散結(jié)，大黃逐瘀通經(jīng)、涼血解毒，甘草調(diào)節(jié)諸藥，可祛痰通絡(luò)、標(biāo)本兼治。

徐磊[17]研究發(fā)現(xiàn)，針灸與康復(fù)訓(xùn)練可以顯著提高大鼠GAP-43的表達(dá)水平，說明通過康復(fù)治療可以有效促進(jìn)大鼠受損神經(jīng)元的軸突修復(fù)與突觸建立，從而有效提高大鼠神經(jīng)可塑性，改善大鼠的運(yùn)動(dòng)功能與認(rèn)知功能。陳露露等[18]研究指出活血醒腦開竅方可以通過抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程，增強(qiáng)神經(jīng)因子表達(dá)水平，加強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能來降低大鼠病灶周圍腦組織的炎性反應(yīng)，提高GAP-43的表達(dá)水平，促進(jìn)大鼠受損腦組織的神經(jīng)功能修復(fù)。2項(xiàng)研究均為在藥物或康復(fù)治療作用下，大鼠GAP-43高表達(dá)從而改善疾病癥狀。本次研究結(jié)果表明，給予大鼠通脈降濁解毒方可以有效改善大鼠的神經(jīng)功能，且其表現(xiàn)出一定的藥物依賴性，高劑量組大鼠的Longa評分與平衡木行走實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒上行走實(shí)驗(yàn)評分均明顯高于模型組與低劑量組，說明高劑量組大鼠的神經(jīng)功能與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于同期其他組別(P<0.05)。觀察各組大鼠GAP-43表達(dá)水平可知，在治療7 d、14 d時(shí)，高劑量組大鼠GAP-43水平明顯高于同期其他組，除正常組外，其他組大鼠GAP-43水平在治療14 d時(shí)均發(fā)生一定的回落，與上文中講到的GAP-43在卒中發(fā)生后即會(huì)出現(xiàn)高表達(dá)，7 d時(shí)達(dá)到峰值，而后逐漸降低的結(jié)果一致，說明通脈降濁解毒方可以提高缺血性腦卒中大鼠GAP-43的表達(dá)水平，從而有效改善大鼠的受損神經(jīng)功能，促進(jìn)大鼠腦功能重塑。

本研究尚存在一些不足之處：研究并未闡明通脈降濁解毒方參與調(diào)節(jié)缺血性腦卒中的作用機(jī)制，僅能通過相關(guān)臨床研究推測通脈降濁解毒方可以降低病灶血管的通透性，從而減少受損腦組織的含水量，避免水腫使神經(jīng)細(xì)胞受到繼發(fā)性損害。此外，藥物能夠有效延緩血管內(nèi)血栓的形成時(shí)間，延緩疾病進(jìn)一步進(jìn)展，并提高大鼠抗缺氧能力。通脈降濁解毒方還能促進(jìn)GAP-43的表達(dá)，改善病灶腦組織的微環(huán)境，促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)與腦功能重塑。至于通脈降濁解毒方的詳細(xì)作用機(jī)制仍需要學(xué)者們進(jìn)行不斷深入探究。

綜上所述，通脈降濁解毒方可以促進(jìn)大鼠受損神經(jīng)功能修復(fù)，改善大鼠神經(jīng)功能與運(yùn)動(dòng)功能，其可能與GAP-43表達(dá)水平的上升有關(guān)。