通痹方藥效部位提取工藝優(yōu)化及抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

趙 雨，王 倩，蘭亞榮，張立明，2，3*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏特色中醫(yī)藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川750004；3.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004)

骨痹是五體痹中的一種，是因風(fēng)寒濕邪久羈人體筋骨關(guān)節(jié)、閉阻經(jīng)脈氣血所致的肢體痹證類疾病[1-2]，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰椎間盤突出癥、強(qiáng)直性脊柱炎、肩周炎等骨傷科痹證。中醫(yī)認(rèn)為“氣血痹阻不通，筋脈關(guān)節(jié)失于濡養(yǎng)”是骨痹的主要病機(jī)，然而西醫(yī)對其病因仍不十分明確。目前西醫(yī)仍缺乏針對該病病因有效的治療措施，且治療時(shí)間長、費(fèi)用高昂、易復(fù)發(fā)。而中藥制劑有其獨(dú)特的優(yōu)勢，表現(xiàn)出整體調(diào)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在緩解癥狀、提高患者生活質(zhì)量方面療效顯著，且副作用小，為多數(shù)患者接受。

通痹方是寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的中藥復(fù)方，專治骨傷科痹證，由沒藥、白胡椒、紅花、川烏、伸筋草、桑枝6味中藥組成[3]，其中川烏、伸筋草溫經(jīng)散寒，白胡椒溫中止痛、散寒除濕，桑枝祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)，沒藥散瘀定痛，紅花活血通經(jīng)、散腫止痛，具有顯著的活血消腫、抗炎通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、除濕止痛等作用[4-5]。該通痹方已在寧夏中醫(yī)醫(yī)院臨床應(yīng)用多年，效果良好，無毒副作用，需要進(jìn)一步研究其藥效成分及藥理作用為新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。因此本文主要就通痹方的提取工藝優(yōu)化和抗炎鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行研究。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性KM小鼠，體質(zhì)量18～22g，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：溫度：(22±2)℃，相對濕度：50%～60%，動(dòng)物房保持通風(fēng)、干燥，自由飲水，鼠料定量飼養(yǎng)。

1.2 藥材與藥品

紅花(安徽泰源中藥飲片有限公司，批號：141016)；沒藥(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：070101)；白胡椒(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：070101)；川烏(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：170101)；桑枝(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：070101)；伸筋草(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：070101)；野木瓜片(廣東和平藥業(yè)有限公司，批號：Z44021242)；雙氯芬酸鈉緩釋片(諾華制藥，批號：H10980297)；復(fù)方對乙酰氨基酚片(西南藥業(yè)股份有限公司，批號：H20013003)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；吐溫-80(100 mL，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(500 g，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；生理鹽水(4.5 g，湖南科倫制藥有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

XL-08B粉碎機(jī)(廣東市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；BWSsn電子計(jì)重稱(廈門佰倫斯電子科技有限公司)；XB 220A電子分析天平等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 工藝路線

根據(jù)通痹方中各味藥的特點(diǎn)，確定提取工藝為先進(jìn)行揮發(fā)油部位提取，再進(jìn)行醇溶性部位提取。

2.2 揮發(fā)油部位提取工藝優(yōu)化[6-7]

2.2.1 供試品溶液制備 取粉碎后的藥材1份，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入沸石2～3粒，加入蒸餾水，浸泡一定時(shí)間后，置于電熱套上，連接揮發(fā)油提取器及球形冷凝管，開啟加熱，開啟冷凝水，溫度保持微沸，直至提取結(jié)束，揮發(fā)油不再增加(照中國藥典2015年版四部《通則2204揮發(fā)油測定法》甲法項(xiàng)下方法進(jìn)行提取)，讀取揮發(fā)油提取器中油狀液體(揮發(fā)油部位)體積并收集于西林瓶中，得到揮發(fā)油部位。

2.2.2 揮發(fā)油提取正交試驗(yàn) 選取浸泡時(shí)間(h)、加水倍數(shù)(倍)、提取時(shí)間(h)三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，采用L9(33)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察水蒸氣蒸餾法對揮發(fā)油提取的影響，以揮發(fā)油量為指標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 揮發(fā)油部位提取正交試驗(yàn)因素水平

2.3 醇溶性部位提取工藝優(yōu)化[8]

2.3.1 供試品溶液制備 將提取揮發(fā)油后的藥液過濾，藥渣置于圓底燒瓶中，加入乙醇，連續(xù)回流，濾過，用乙醇清洗藥渣和容器，濾液旋至稠浸膏狀，用乙醇轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，自然揮干乙醇后，置于烘箱烘干，即得醇溶性部位。

2.3.2 醇提正交實(shí)驗(yàn) 選取乙醇濃度(%)、乙醇用量(mL/g)、提取時(shí)間(h)三個(gè)影響因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，用L9(33)正交表實(shí)驗(yàn)優(yōu)選乙醇回流提取工藝，以方中胡椒堿含量(色譜峰峰面積)為指標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 醇部位提取正交試驗(yàn)因素水平

2.4 高效液相法(HPLC)測定醇溶性部位有效成分(胡椒堿)含量

2.4.1 色譜條件 C18柱；流動(dòng)相：甲醇-水(77∶ 23)；檢測波長：343 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣10 μL；柱溫：25 ℃。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取胡椒堿對照品0.005 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作對照品溶液，備用。

2.4.3 供試品溶液制備 分別精密稱取各組醇部位浸膏約0.1 g，置于已編號(①～⑨)的10 mL容量瓶中，加甲醇溶解(必要時(shí)可超聲加速溶解)，并定容至刻度，做供試品溶液備用。0.45 μm微孔濾膜過濾，分別置于已標(biāo)號(①～⑩)的進(jìn)樣瓶中，照色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣，記錄峰面積及保留時(shí)間(表7)。

2.4.4 方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系。精密吸取不同濃度的對照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制工作曲線見圖1。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，線性回歸，得回歸方程。

(2)精密度。分別精密吸取③號醇部位供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果見表9。

(3)穩(wěn)定性。精密吸取③號醇部位供試品溶液，分別于放置0、3、6、9、12、24 h后進(jìn)樣，記錄色譜圖，峰面積見表10。

(4)重復(fù)性。取③號醇部位供試品，按供試品溶液制備方法，平行制備6份溶液，依法進(jìn)樣，峰面積見表11。

2.5 抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[9-12]

2.5.1 熱板法致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn) 將60只SPF級小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為：①空白對照組(1 mL1%吐溫-80+生理鹽水)；②揮發(fā)油組(3 mL/kg，由1%吐溫-80+生理鹽水制成溶液)；③醇部位組(以通痹方生藥量計(jì)，下同)(3 g/kg，由0.5% CMC-Na制成混懸液)；④揮發(fā)油+醇部位組(1.5 mL/kg+1.5 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；⑤陽性對照組1(對乙酰氨基酚，0.3 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；⑥陽性對照組2(野木瓜片1.2 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)。

將熱板箱放入裝滿水的恒溫水浴鍋中，使水溫控制在(55±0.5)℃ (用溫度計(jì)測量)。熱板箱預(yù)熱 10 min后，將70只雌性小鼠逐只放入熱板箱中，用秒表記錄小鼠自放入熱板箱后至出現(xiàn)舔后足的時(shí)間(s)作為每只小鼠的痛閾值。每日定時(shí)給各組小鼠進(jìn)行灌胃給藥1次，根據(jù)小鼠體重確定給藥量，連續(xù)7 d，空白組除外，末次給藥后30 min、1 h各測1次痛閾，凡在熱板上60 s內(nèi)無反應(yīng)的小鼠立刻取出，痛閾值以60 s計(jì)(以免燙傷小鼠足趾)。

2.5.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 將60只SPF級小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為：①空白對照組(1%吐溫-80+生理鹽水)；②揮發(fā)油組(3 mL/kg，由1%吐溫-80+生理鹽水制成溶液)；③醇部位組(3 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；④揮發(fā)油+醇部位組(1.5 mL/kg+1.5 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；⑤對照1(雙氯芬酸鈉，0.04 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；⑥對照2(野木瓜片1.2 g/kg，由0.5% CMC-Na制成混懸液)，除空白組外，每日定時(shí)給各組小鼠進(jìn)行灌胃給藥1次，根據(jù)小鼠體重確定給藥量，連續(xù)7 d，末次給藥30 min后，各組小鼠右耳廓前后均勻涂抹二甲苯0.02 mL/只致炎，左耳作對照。

半小時(shí)后脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下雙耳，并采用直徑為7 mm的不銹鋼打孔器將小鼠雙耳同部位等面積切下，分析天平稱重，計(jì)算兩耳重量之差，小鼠左右兩側(cè)耳片重量差即為腫脹度，計(jì)算各組小鼠耳腫脹抑制率(%)。耳腫脹抑制率(%)=(空白組組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度) /空白組平均腫脹度×100%。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油部位提取工藝優(yōu)化

表3 揮發(fā)油部位提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 結(jié)果分析

根據(jù)表1揮發(fā)油因素水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，讀取揮發(fā)油毫升數(shù)，最終得出結(jié)果見表3：在實(shí)驗(yàn)條件下?lián)]發(fā)油最優(yōu)提取工藝為A3B1C3(加水10倍，浸泡1 h，提取10 h)。各因素對揮發(fā)油提取率的影響順序?yàn)镃>B>A，即提取時(shí)間>加水倍數(shù)>浸泡時(shí)間。見表4。

3.2 醇部位提取工藝優(yōu)化

表5 醇部位提取正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2醇部位因素水平表實(shí)驗(yàn)，通過高效液相色譜法確定醇部位指標(biāo)性成分含量(見表5)，最終得出結(jié)果見表6、表7。在該實(shí)驗(yàn)條件下，醇部位最優(yōu)提取工藝為A3B1C3(乙醇濃度85%，乙醇用量6倍，提取時(shí)間3 h)。各考察因素對醇部位提取率的影響順序?yàn)锳>B>C，即乙醇濃度>乙醇用量>提取時(shí)間。

3.3 HPLC測定醇溶性部位有效成分(胡椒堿)含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下對標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行稀釋，以胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見圖1。結(jié)果表明，胡椒堿在0.000 5～0.012 5 mg/μL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.984 9。

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下對樣品進(jìn)行測定，精密度實(shí)驗(yàn)中色譜峰保留時(shí)間RSD為0.14%，峰面積RSD為0.19%，表明該方法的精密度良好；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中色譜峰保留時(shí)間RSD為1.08%，峰面積RSD為0.24%，說明穩(wěn)定性良好，樣品至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中色譜峰保留時(shí)間RSD為1.31%，峰面積RSD為0.26%，說明該方法重復(fù)性良好。詳見表8、表9、表10。

表6 結(jié)果分析

表7 HPLC法測定醇部位指標(biāo)性成分含量結(jié)果

圖1 線性關(guān)系考察

表8 精密度考察

表9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察

表10 重復(fù)性測定

3.4 抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

3.4.1 熱板法致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，通痹方揮發(fā)油組、醇部位組、揮發(fā)油+醇部位組在給藥0 min、15 min和30 min后均對熱刺激小鼠所致疼痛反應(yīng)潛伏期(痛閾值)升高，其中醇部位組、揮發(fā)油+醇部位的小鼠在給藥15、30 min后熱刺激所致疼痛反應(yīng)潛伏期(痛閾值)較其他給藥組顯著升高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通痹方中揮發(fā)油、醇部位、揮發(fā)油+醇部位對熱板所致的小鼠疼痛均有抑制作用，但揮發(fā)油+醇部位抑制疼痛作用較其他部位更顯著，且在給藥30 min后抑制疼痛效果顯著(P<0.05)。結(jié)果見表11。

表11 通痹方對熱板致小鼠疼痛反應(yīng)的影響

3.4.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，各給藥組在給藥30 min后對二甲苯引起的小鼠的耳腫脹均有抑制作用。其中，通痹方醇部位較其他給藥組對二甲苯引起的小鼠的耳腫脹有顯著抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腫脹抑制率達(dá)到了33.4%。表明通痹方中各部位具有一定的抗炎作用，醇部位較其他部位抗炎作用強(qiáng)。結(jié)果見表12。

表12 通痹方對二甲苯致小鼠急性耳腫脹抑制率的影響

4 討論

在中醫(yī)理論中，痹證、頑痹、痛風(fēng)等是由于正氣不足、氣血運(yùn)行不暢而引起的表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、屈伸不利等癥狀的一類疾病。該病在臨床上以膝關(guān)節(jié)疼痛反復(fù)發(fā)作、關(guān)節(jié)變形及不同程度的功能障礙為特點(diǎn)[13-14]，可伴有體重減輕、低熱、疲乏感、晨僵、疼痛、畸形、類風(fēng)濕結(jié)節(jié)等全身癥狀。

通痹方是由沒藥、白胡椒、紅花、川烏、伸筋草、桑枝組成的經(jīng)驗(yàn)方，方中藥物含有豐富的揮發(fā)油、生物堿與黃酮類成分。沒藥揮發(fā)油、白胡椒揮發(fā)油、紅花黃色素、桑皮苷、烏頭堿等能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹及大鼠蛋清所致的足趾腫脹，提高小鼠痛閾值。該方劑理論和臨床應(yīng)用基礎(chǔ)良好。

本研究結(jié)果顯示，通痹方揮發(fā)油部位的最優(yōu)提取工藝為：加水10倍，浸泡1 h，提取10 h。醇部位的最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度85%，乙醇用量6倍，提取時(shí)間3 h。在抗炎鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，與空白對照組相比，末次給藥0、15、30 min后，通痹方醇部位和揮發(fā)油+醇部位組的小鼠熱刺激所致疼痛反應(yīng)潛伏期(痛閾值)顯著提高(P<0.05)，其鎮(zhèn)痛作用明顯。在抗炎實(shí)驗(yàn)中，只有醇部位組，小鼠耳腫脹抑制率達(dá)到了33.4%，與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而揮發(fā)油組、揮發(fā)油+醇部位組小鼠耳腫脹抑制率與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，經(jīng)過提取工藝優(yōu)化過的通痹方具有明顯的抗熱刺激痛作用，并具有一定的抗炎效果，但其抗炎鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制和相關(guān)通路還有待進(jìn)一步研究。