用反相高效液相色譜法同時測定復方酮康唑軟膏中三組分的含量

吳 博，王鐵柱，拜 年，劉 冰，宋洪濤 （. 新疆醫科大學第一附屬醫院藥劑科，新疆 烏魯木齊 80000；. 新疆醫科大學第四附屬醫院重癥醫學科，新疆 烏魯木齊 80000；. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院藥學科，福建 福州 5005）

市售復方酮康唑乳膏包含酮康唑、硫酸新霉素和丙酸氯倍他索，是治療淺部真菌感染的常用藥物。其中，酮康唑是最常用的抗真菌藥物，具有價格低、抗菌譜廣、抗真菌活性強等優勢。但細菌對硫酸新霉素易產生耐藥性，可導致患者反復感染，難以根治，且丙酸氯倍他索不適合12 歲以下兒童使用，副作用較多，可產生紅斑、灼熱、瘙癢等刺激癥狀，長期大面積用藥可導致高血糖等[1-5]。針對上述問題，為改善市售產品的有效性和安全性，本課題組將硫酸新霉素替換為抗菌作用更強的莫匹羅星，將丙酸氯倍他索替換為副作用較少的糠酸莫米松，再結合酮康唑，制備新型復方酮康唑軟膏，以提高患者的用藥依從性[6-8]。

本研究采用反相高效液相色譜法同時測定復方酮康唑軟膏中酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松3 種藥效成分的含量，該方法目前未見有文獻報道。本法簡便，靈敏，分離度好，準確性高，可以為該制劑的質量標準研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AL204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TU-1901 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Starter 2C 型實驗室pH 計（奧豪斯儀器有限公司）；KQ-800KDE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

酮康唑對照品（批號：100294-201203，含量99.4%）、莫匹羅星對照品（批號：130568-200501，含量94.2%）、糠酸莫米松對照品（批號：100930-201201，含量99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；酮康唑原料藥（批號：20130405）、莫匹羅星原料藥（批號：20130301）、糠酸莫米松原料藥（批號：20130228）均購自武漢鑫佳公司；聚乙二醇400 和聚乙二醇3 350（中國醫藥對外貿易公司）。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的確定

分別取酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松適量，精密稱定，加流動相制備成適宜濃度的溶液，以相應的溶劑為空白溶液，在190～400 nm 波長范圍內進行紫外掃描，結果見圖1。

圖1 莫匹羅星、糠酸莫米松和酮康唑的紫外圖譜

由圖1 可見，莫匹羅星在220 nm 處具有最大吸收波長，糠酸莫米松在248 nm 處具有最大吸收波長，酮康唑在203 nm 和245.5 nm 具有最大吸收波長，三者在220 nm 與248 nm 之間均有吸收，因在供試品中酮康唑和莫匹羅星的濃度均是糠酸莫米松的20 倍，糠酸莫米松在220 nm 處響應值較小，為保證3 種藥物能同時測定，確定酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松的檢測波長為248 nm。

2.2 色譜條件及系統適用性

色譜柱：Intersil ODS-3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-pH5.5 磷酸鹽緩沖液(65∶35)，柱溫45 ℃，流速1.0 ml/min，檢測波長248 nm，進樣量10 μl。理論塔板數以各組分峰計，均不低于5 000，各色譜峰的分離度良好。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液

酮康唑對照品溶液：取酮康唑20 mg，精密稱定，置10 ml 量瓶中，加入適量65%甲醇，超聲使其完全溶解，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到酮康唑的標準儲備液，4 ℃低溫避光保存。精密吸取酮康唑的標準儲備液1 ml，置于10 ml 量瓶中，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

莫匹羅星對照品溶液：取莫匹羅星20 mg，精密稱定，置10 ml 量瓶中，加入適量65%甲醇，超聲使其完全溶解，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到莫匹羅星的標準儲備液，4 ℃低溫避光保存。精密吸取莫匹羅星的標準儲備液1 ml，置于10 ml 量瓶中，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

糠酸莫米松對照品溶液：取糠酸莫米松10 mg，精密稱定，置100 ml 量瓶中，加入適量65%甲醇，超聲使其完全溶解，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到糠酸莫米松的標準儲備液，4 ℃低溫避光保存。精密吸取糠酸莫米松的標準儲備液1 ml，置于10 ml 量瓶中，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

混合對照品溶液：取酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松的標準儲備液各1 ml，置10 ml 量瓶中，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液

取復方酮康唑軟膏0.5 g，精密稱定，置于50 ml的容量瓶中，加65%甲醇適量，超聲溶解，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液

取空白軟膏基質0.5 g，精密稱定，置于50 ml的容量瓶中，加65%甲醇適量，超聲溶解，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得陰性對照溶液。

2.4 專屬性考察

取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，棄去初濾液，續濾液分別按照上述色譜條件進樣，記錄色譜圖及相關參數。莫匹羅星的保留時間為5.075 min，理論塔板數為9 196，對稱因子0.81；糠酸莫米松的保留時間為18.413 min，理論塔板數為11 859，對稱因子0.88；酮康唑的保留時間為23.318 min，理論塔板數為12 291，對稱因子0.89，空白基質對莫匹羅星、糠酸莫米松和酮康唑的測定無干擾，方法專屬性好。對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液色譜見圖2。

圖2 復方酮康唑軟膏的RP-HPLC 色譜圖

2.5 線性關系考察

分別精密吸取酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松標準儲備液各0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2 ml，置10 ml 量瓶中，用65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，棄去初濾液，續濾液按上述色譜條件分別進樣10 μl，記錄色譜圖峰面積。以峰面積A 對濃度C (μg/ml)進行線性回歸，結果見表1。

表1 復方酮康唑軟膏中主藥的線性方程

2.6 重復性試驗

分別精密量取同一批復方酮康唑軟膏6 份，每份約0.5 g，按“2.3.2”項下操作，測定，計算酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松含量。結果見表2，結果表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12、24 h 進樣10 μl 測定，計算不同時間點莫匹羅星、糠酸莫米松和酮康唑的含量，結果見表3。

2.8 回收率試驗

分別精密稱取莫匹羅星8、10、12 mg，糠酸莫米松0.4、0.5、0.6 mg，酮康唑8、10、12 mg（相當于標示量的80%、100%、120%），精密稱定，分別置于0.5 g 的空白基質中，加適量流動相溶液，超聲10 min 使溶解，置于50 ml 量瓶中，加流動相溶液稀釋至刻度，搖勻，得低、中、高不同濃度的溶液，每個濃度各3 份。用0.22 μm 微孔濾膜過濾，棄去初濾液，續濾液按上述色譜條件分別進樣，記錄色譜圖峰面積。根據回歸方程計算出相應濃度和含量，并計算回收率、平均回收率及RSD。結果見表4。

表2 復方酮康唑軟膏中三種主藥的重復性試驗結果

表3 復方酮康唑軟膏中三種主藥的穩定性試驗結果

表4 復方酮康唑軟膏中三種主藥回收率試驗結果(n=3)

2.9 樣品含量測定

取3 批樣品，依法測定，結果見表5。

表5 3 批次樣品含量測定結果(n=3，%)

3 討論

3.1 提取方法的優化

本研究根據軟膏劑的特性，選擇了提取效率較高，操作簡便的超聲提取法進行樣品前處理，對溶劑種類、溶劑體積、提取時間進行考察，最終選擇65%甲醇50 ml，超聲提取10 min，該提取方法可有效的除去樣品中的雜質，讓測定的專屬性更高。

3.2 色譜條件的選擇

對于流動相的選擇，本實驗嘗試以甲醇-0.6%醋酸銨溶液作為流動相[9-12]，結果基線非常不穩定，這可能是由于醋酸銨的紫外吸收所造成。以甲醇-水、乙腈-水，甲醇-磷酸二氫鈉溶液和甲醇-乙腈-水等作為流動相[13-15]，使用磷酸二氫鈉溶液分離效果及峰形較好，有機相甲醇的比例應控制在一定范圍，甲醇低于50%則酮康唑峰保留時間過長；流動相的酸度對酮康唑（弱堿性）和莫匹羅星（弱酸性）[16]的峰形及保留時間亦有影響，用磷酸將磷酸二氫鈉的pH 值調節到4.5、5.0、5.5 和6.0。結果表明，當流動相的pH 值為5.5 時，莫匹羅星、糠酸莫米松和酮康唑的三組峰值均具有較好的分離度，并且無前延和拖尾現象。對于檢測波長的選擇，酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松在220 nm 與248 nm均有吸收，因在供試品中酮康唑和莫匹羅星的濃度均是糠酸莫米松的20 倍，為了讓這三種藥物能同時測定，提高檢測的靈敏度，確定最佳檢測波長為248 nm。對于色譜柱的選擇，本研究考察了島津、安捷倫和沃特世等品牌的色譜柱，最終選擇了島津Intersil ODS-3 柱，三種待測成分在該柱上分離度好，峰形佳，所以確定為最佳色譜柱。

3.3 含量測定結果分析

3 個批次的復方酮康唑軟膏均為實驗室自制，從測定結果可以看出，不同批次的樣品中酮康唑、莫匹羅星和糠酸莫米松的含量有一定波動，這提示我們在進行中試放大生產時，要充分考慮各因素的影響，保證制劑中主要成分的含量穩定，同時對軟膏劑的長期穩定性也需要進行考察。