微波消解-電感耦合等離子體原子發射光譜法測定全血中的鑭

張靜如，華俊杰，韓 凌，朱 敏，魯 瑩 （海軍軍醫大學藥學院藥劑學教研室，上海 200433）

針對海訓需求，本課題組研制出一款能同時滿足防曬和防水母蟄傷需求的防水型多效防護乳，對于增強海軍部隊日常海訓強度和提高海軍戰斗力具有重要作用和意義。經文獻和相關專利調查，以及初步藥效學評價[1-5]，本課題確定以LaCl3·7H2O(500 mmol/L)、 MgCl2·6H2O(25 mmol/L)、 CaCl2(25 mmol/L)的水溶液作為防水母蟄傷成分加入到基質處方中。鑭是一種重要的稀土元素，廣泛應用與電子、醫藥、生物醫學等領域，有文獻報道[6-9]，鑭離子暴露可能會導致人的健康問題，對閾值效應而言，需要進行未觀察到有害作用劑量（NOAEL）的測定。防護乳長期、大量涂抹，而且很可能接觸破損的皮膚，鑭離子（La3+）可能通過經皮吸收進入人體體循環，而其在體內的毒性或潛在毒性均未明確。此外，迄今為止，未見含鑭乳膏的透皮安全性的報道，所以必須對防護霜中添加的鑭離子進行安全性驗證。

電感耦合等離子體發射光譜技術具有分析速度快、線性范圍寬、可多元素同時測定、檢出限低等特性，已被廣泛地應用于各類物質中無機元素的分析檢測[10]。本文以鑭元素為檢測對象，結合微波消解與電感耦合等離子體發射光譜（ICP-OES）技術，建立一種體內含量分析方法，可為多效防護乳的質量分析和透皮安全性評價提供基礎數據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Scientific iCAP6000 系列電感耦合等離子體光譜儀，包括RF 發生器、光譜儀系統和光電轉換檢測器、iTEVA 工作站（美國賽默飛世爾公司）；MDS-6G 多通量微波消解/萃取系統（上海新儀微波化學科技有限公司）；AL-104 電子天平（瑞士梅特勒公司）；VORTEX-6 渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器有限公司）；Barnstead D3750 超級純水儀（美國賽默飛世爾公司）。

1.2 藥品與試劑

硝酸（優級純，批號：20190920）購自國藥集團化學試劑有限公司；La 元素標準溶液（濃度1 000 μg/ml）購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；水為超純去離子水(≥18.2Ω)；多效防護乳（批號：82004163）為中試放大樣品。

1.3 實驗動物

SD 大鼠，均為雄性，體重約250 g，昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司提供，許可證號（蘇）2018-0006。

2 方法與結果

2.1 全血樣品采集

給藥前，盡可能剃掉大鼠背部及兩側體毛，約5 cm×10 cm，休息觀察24 h。實驗前禁食12 h，自由飲水。實驗前，將大鼠編號，用丙酮輕輕擦去皮脂。然后以0.4 g/cm2的劑量分別將防護乳均勻涂布在大鼠裸露皮膚表面。分別于給藥前和給藥后1 h 在眼眶靜脈叢取血1ml，置于肝素化的離心管中，于?20 ℃條件下保存。

2.2 儀器工作參數

iCAP6000 系列電感耦合等離子體光譜儀最佳化后工作條件為：射頻功率1 150 W；采樣深度5 mm；冷卻氣流量12 L/min；輔助氣流量0.5 L/min；泵轉速45 r/min。樣品沖洗時間30 s；樣品測定次數3 次。微波消解儀參數和檢測程序如表1 所示。

表1 全血樣品微波消解程序

2.3 供試品溶液的制備

準確吸取血樣1 ml，置于聚四氟乙烯燒杯中，加入硝酸8 ml，混勻，在電熱板上于120 ℃加熱預消解20 min，血樣可完全溶解為黃色的消解液；然后，按照表1 程序將樣品置于微波消解儀中完全消解。取出樣品置于160 ℃的電熱板上加熱趕去硝酸，消解液呈無色透明或略帶黃色，直到四氟乙烯杯剩余溶液小于1 ml 時，將消解液轉移至10 ml 量瓶中，用2%硝酸溶液洗滌容器，洗液合并于量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，得到供試品溶液。未經給藥處理的血樣經過上述消解程序得到的溶液即為空白基質溶液。

2.4 對照品溶液的制備

精密量取La 元素標準溶液1 ml，置10 ml 量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，得到濃度為100 μg/ml 的儲備液(A)。精密量取儲備液0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ml，分別置50 ml 量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/ml 的一系列對照品溶液。

2.5 方法學驗證

2.5.1 專屬性試驗

將空白溶液（2%硝酸溶液）、空白基質溶液、對照品溶液和供試品溶液依次注入等離子體光譜儀，檢測并記錄結果，其圖譜如圖1 所示，結果表明La 在333.749 nm 處譜線干擾較少，對照品溶液和供試品溶液的峰形較好，空白溶液和空白基質溶液在此譜線無響應，方法的專屬性較好。

圖1 鑭的專屬性圖譜

2.5.2 線性與定量限

將“2.4”項下制備的對照品溶液依次注入ICPOES，檢測并記錄結果。結果表明，在0.1～5 μg/ml濃度范圍內，儀器響應值與濃度呈良好線性關系，La 的線性方程為Y=33 730X-774.4，r=0.999 8。

將2%硝酸溶液注入ICP-OES 進行測試，連續進樣11 次，以空白溶液響應值標準偏差的3.3 倍計算檢出限，以空白溶液響應值標準偏差的10 倍計算定量限。方法檢出限為0.002 5 μg/ml，定量限為0.007 7 μg/ml。

2.5.3 準確度

精密量取空白血樣9 份于燒杯中，各1 ml, 分別精密加儲備液0.16、0.2、0.24 ml，低、中、高每個濃度平行配制3 份。隨后按照“2.3”項下樣品的處理方法進行制備，即得空白加標溶液。將空白基質溶液和空白加標溶液分別注入儀器，進樣分析，結果見表2。La 的低、中、高濃度的回收率均在94.9%～102.0%之間，表明本法的回收率良好。

表2 空白血樣加標回收率試驗結果

2.5.4 重復性

取同一批血樣（給藥后1 h 取血樣本）共6 份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣分析。結果La 含量的RSD 為1.01%，表明本法的重復性良好。

2.6 樣品測定

4 組樣品在1 h 的取血時點所測得的La 的濃度（μg/ml）如表3 所示。

表3 全血樣品在給藥后1 h 測得的鑭濃度（μg/ml，n=4）

3 討論

3.1 鑭的安全性

La 不是人體必需元素，已有研究表明[7,9,11]鑭具有潛在的毒性，包括神經行為和認知行為功能障礙，可致肝功能下降，對骨、腎、脾臟、免疫系統均具有負面影響。鑭可從農產品通過胃腸道進入人體，但是經皮吸收進入人體體循環的情況尚未可知，未見有La 的經皮安全性評價的報道。本次試驗建立了La 元素的生物樣本體內分析方法，為單次涂抹含鑭防護乳后24 h 的透皮安全性研究提供了新的方法和思路。

3.2 前處理方法的優化

全血中無機元素的分析常通過兩種途徑：一是以TritonX-100 水溶液或去離子水直接稀釋進樣測定；二是通過傳統的干灰化法、濕法消解或微波消解法將血樣完全消解后進樣測定[12]。由于全血中含有大量蛋白質等物質，直接稀釋干擾較多，與濕法、干法消解法相比，微波消解具有加熱快、消解完全、消耗試劑少、節能環保等優點[13]，故本研究選擇微波消解法對全血樣品進行處理。常用的消解溶劑有HNO3、HF、H2O2、HClO4等[14]，本實驗采用HNO3，即可將血液樣品消解為近無色的澄清液體（消解完全），避免了H2O2、HClO4等易爆溶劑的使用。

3.3 La 測定方法的建立

本文通過微波消解-ICP-OES 法，建立了生物樣本中La 的測定方法，該方法操作簡單，分析速度快，靈敏度高，準確度好，為多效防護乳中La 的含量測定和安全性評價提供依據。