豬圓環病毒2 型和3 型雙重熒光PCR檢測方法建立及應用

翟少倫，婁亞坤，杜麗銀，溫肖會，翟頎，周秀蓉，賈春玲，霍瑋，陳美霞，楊燕秋，吳國景，呂殿紅

（1.廣東省農業科學院動物衛生研究所/ 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/ 農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站廣州 510640；2.鄭州中道生物技術有限公司鄭州 450000；3.紫金縣動物疫病預防控制中心廣東河源 517400）

豬圓環病毒（porcinecircovirus，PCV）屬于圓環病毒科（Circoviridae）圓環病毒屬（Circovirus），目前基因型分為PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4[1,2]。其中PCV1 對豬無致病性，PCV2 是目前已知的最小脊椎動物病毒之一，基因組大小約為1.7kb，包含2個主要的開放閱讀框，ORF1 和ORF2 分別編碼復制酶（Re p）和衣殼蛋白（Ca p）。PCV2 自從被發現以來，相繼在世界各地暴發流行，主要感染家豬和野豬，可引起母豬繁殖障礙、斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、壞死性淋巴結炎、滲出性皮炎等一系列疾病，且PCV2 感染后可引起免疫細胞損傷，導致機體免疫力下降，具有養豬業的“隱形殺手”之稱，使全球養豬業遭受了巨大的經濟損失。

PCV3 是PCV 的一種新基因型，2015 年在美國北卡羅來納州發生豬皮炎腎病綜合征和繁殖障礙的豬場中最先發現，之后有報道稱PCV3 與心肌炎和腎小球腎炎有關[3,4]。該病毒全基因組大小為2kb，結構與PCV2 類似，包括Rep和Cap兩個主要蛋白，但與PCV2Cap蛋白的同源性較低，約為30%。2017 年湖北、廣東、安徽等多個省份的豬場陸續檢測到PCV3 感染豬群的現象，雖然不同地區PCV3 全基因組存在差異，但同源性較高。PCV3 感染可能導致豬群發生如皮炎和腎病綜合征、斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、仔豬先天性震顫等一系列相關疾病。同時在研究中發現，豬群中存在PCV2 和PCV3 混合感染的情況，且混合情況較為嚴重。PCV4 在我國湖南豬群中發現，目前的檢測數據顯示，其流行率較低，且與豬病的相關性還不明朗[2,5,6]。

鑒于PCV2 和PCV3 在臨床上的混合感染以及高度相似的臨床特征，因此加強PCV2 和PCV3 的鑒別診斷對豬圓環病毒病的防控尤為重要，且建立一種快速、可靠的同時檢測PCV2 和PCV3的方法對于豬圓環病毒病的臨床診斷和流行病學調查意義重大。

1 引物和探針設計

通過比對GenBank上收錄的PCV2基因序列，確定保守序列，并針對該區域設計特異性的引物探針，用于檢測PCV2。經過大量設計并篩選出PCV2-F1 和PCV2-R1 為上下游引物，PCV2-P1為探針，所述引物組和探針的核苷酸序列分別為：

PCV2-F1：5'-AYAACAAAAGRAATCAG(A)C-3'；

PCV2-R1：5'-TGTACATACATGGTTACACG-3'；

PCV2-P1：5'-FAM-TACGACCAGGAMTACA-BHQ1-3'。

通過比對GenBank上收錄的PCV3基因序列，確定保守序列，并針對該區域設計特異性的引物探針，用于檢測PCV3。經過大量設計并篩選出PCV3-F2 和PCV3-R2 為上下游引物，PCV3-P2為探針，所述引物組和探針的核苷酸序列分別為：

PCV3-F2：5'-TGGCTCAACACATATGAC-3'；

PCV3-R2：5'-ACGGACTTGTAACGAATC-3'；

PCV3-P2：5'-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ 1-3'。

2 陽性質粒構建

人工合成PCV2 靶基因序列（Ge nBa nk 登錄號：KT719404）和PCV3 靶基因序列（Ge nBa nk 登錄號：MK580466），兩端基因均連接至載體上，將重組的載體DNA 作為陽性質粒，進行PCR 擴增。

3 PCR體系及反應條件優化

以制備的陽性質粒，用引物組PCV2-F1、PCV2-R1和PCV3-F2、PCV3-R2，探針PCV2-P1和PCV3-P2在最優擴增條件下對稀釋好的質粒標準品進行熒光PCR擴增，擴增體系為：PCV2-F10.166μL，PCV2-R10.211μL，PCV2-P10.203μL，PCV3-F20.190μL，PCV3-R20.188μL，PCV3-P20.247μL，Fast-FireqPCRPreMix12.5μL，DNA模板5μL，ddH2O補足25μL。擴增程序為：95℃，3min；95℃變性15s，55℃退火延伸3s，循環40次，收集熒光信號，PCV2選擇FAM通道和PCV3選擇HEX通道，獲得擴增曲線。

4 PCR特異性試驗

分別提取DNA 或RNA，制備豬細小病毒DNA 基因組、豬偽狂犬病毒DNA 基因組、豬瘟病毒c DNA 全基因組、豬繁殖與呼吸綜合征病毒c DNA 全基因組、豬流行性腹瀉病毒c DNA 全基因組、豬健康組織（血液、皮膚組織）DNA 基因組作為特異性質控品，并分別作為模板進行熒光PCR 檢測，按體系配制試劑和設置反應程序。結果顯示，檢測結果均為陰性，本試劑盒特異性良好。

5 PCR敏感性試驗

用紫外吸收法測重組質粒的濃度，先調整重組質粒的濃度至104c op ie s/μL，用d d H2O 對陽性質粒進行10 倍倍比稀釋，稀釋范圍為10-1～10-4，分別作為模板進行PCR 檢測。按反應體系配制試劑和設置反應程序。結果顯示，本試劑盒的最低檢出限為10copies/μL，表明本試劑盒有較高的靈敏度，如圖1。

圖1 PCR 靈敏度試驗結果

6 PCR結果判定

6.1 試驗有效性判定

陽性對照在FAM 和HEX 通道均有典型擴增曲線且Ct 值≤30，且陰性對照在FAM 和HEX通道均無Ct 值、無擴增曲線，則判試驗結果有效；否則，此次試驗視為無效。

6.2 樣品判定

1）待檢樣品僅FAM 通道出現典型擴增曲線且Ct 值≤38，判定為PCV2 核酸陽性；若38＜Ct 值≤40 判定為可疑，建議重復檢測，檢測結果仍然為Ct 值≤40 則判為陽性。無擴增曲線且無Ct值，判為陰性；

2）待檢樣品僅HEX通道出現典型擴增曲線且Ct 值≤38，判定為PCV3 核酸陽性；若38＜Ct 值≤40 判定為可疑，建議重復檢測，檢測結果仍然為Ct 值≤40 則判為陽性。無擴增曲線且無Ct值，判為陰性。

7 PCR臨床應用

取實驗室用單重商品化熒光PCR 檢測試劑盒鑒定為PCV2或PCV3 核酸陽性的樣品30 份，分別用本研究建立的PCV2 和PCV3 雙重熒光PCR 檢測方法檢測，結果與商品化熒光PCR 檢測試劑盒檢測結果一致，表明該雙重熒光PCR 檢測方法具有更好的集成性和靈敏性。

8 小結與討論

本研究根據PCV2 和PCV3 臨床上混合感染的情況，設計了特異性的引物和探針，建立了PCV2 和PCV3 二重熒光PCR 檢測方法。該方法比傳統的普通PCR 方法、單重熒光PCR 方法更具有高通量性，適合第三方獸醫檢測實驗室對大量樣品開展檢測。