磁珠法和柱式法提取核酸在新城疫熒光定量檢測(cè)中的比較

王軍，何長(zhǎng)生，王維，王倩，周迎春

（安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心合肥 230091）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）強(qiáng)毒株引起的、以感染禽類(lèi)為主的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病[1]，具有很高的發(fā)病率和死亡率，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，曾在世界范圍內(nèi)引起三次大的流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，該病與高致病性禽流感并列為世界公認(rèn)的最重要的2 個(gè)禽類(lèi)疫病[2,3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將新城疫列為A 類(lèi)疫病，我國(guó)將其列入一類(lèi)動(dòng)物疫病[4]。

目前檢測(cè)新城疫病毒的常用方法為熒光定量RT-PCR，該方法比常規(guī)的檢測(cè)方法用時(shí)少、周期短、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便[5]，且不易引起污染，還可用于病毒的定量分析。在檢測(cè)過(guò)程中，提取核酸是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因?yàn)樘崛『蟮暮怂豳|(zhì)量及其完整性會(huì)直接影響到后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果[6]。本研究選用實(shí)驗(yàn)室常用的磁珠法和柱式法提取病毒核酸進(jìn)行熒光定量RT-PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種提取方法在靈敏度及重復(fù)性等方面存在差異?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與設(shè)備King Fisher Flex 96 通道全自動(dòng)核酸提取儀，微量移液器，MIKRO 200R 高速冷凍離心機(jī)，BIO-RAD CFX Connect 熒光定量PCR 儀。

1.1.2 檢測(cè)試劑新城疫病毒熒光RT-PCR 試劑盒，購(gòu)自深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)科技有限公司，批號(hào)：66080；病毒核酸（RNA）抽提試劑盒（離心柱式），購(gòu)自深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)科技有限公司，批號(hào)：69015；病毒核酸提取試劑（磁珠法），購(gòu)自廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：CZD00412。

1.1.3 樣品2020 年主要禽病流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)中，篩查出的新城疫陽(yáng)性樣品（雞咽泄拭子和環(huán)境拭子），共22 份。

1.2 方法

1.2.1 磁珠法將拭子樣品混勻，靜置3～5min，取200μL上清，由King Fisher Flex 96 通道全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸，最后獲得100μLRNA 溶液。

1.2.2 柱式法將拭子樣品混勻，靜置3～5min，取100μL上清到1.5mL潔凈離心管中，加入200μL裂解液、3μLCa rrie r RNA，渦旋混勻20s，室溫靜置5min，然后加入150μL無(wú)水乙醇，顛倒混勻，短暫低速離心除去管蓋上的液體，小心將混合液體轉(zhuǎn)移至純化柱管內(nèi)，12,000rp m 離心1min，倒棄廢液收集管內(nèi)液體。打開(kāi)管蓋，加入450μL洗液1，12,000rp m 離心1min，倒棄廢液收集管內(nèi)液體；打開(kāi)管蓋，加入500μL洗液2，12,000rp m 離心1min，倒棄廢液收集管內(nèi)液體；再加入500μL無(wú)水乙醇，12,000rp m 離心1min，倒棄廢液收集管內(nèi)液體，再于12,000rp m 離心3min，丟棄廢液收集管。將純化柱取出放進(jìn)1.5mL潔凈的離心管中，打開(kāi)管蓋，室溫干燥3min 后，向膜片中央小心加入50μL 洗脫液，室溫放置1min，12,000rp m 離心1min，最后獲得50μLRNA 溶液。

1.2.3 熒光RT-PCR 法PCR 各個(gè)組分所需要的量，按（n+1）公式計(jì)算，然后分別吸取混入同一滅菌1.5mL進(jìn)口離心管中，渦旋振蕩、瞬時(shí)離心后，分裝至PCR 反應(yīng)管中。向PCR 反應(yīng)管中加入5μL核酸，標(biāo)明位置后放入BIO-RAD CFX Connect熒光定量PCR儀，按試劑盒說(shuō)明書(shū)編程運(yùn)行。

2 結(jié)果

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，磁珠法吸取200μL樣品，加100μLElutionbuffer，最后獲得100μLRNA 溶液；柱式法吸取100μL樣品，加50μLElutionbuffer，最后獲得50μLRNA 溶液。兩種提取方法樣品用量與獲得核酸體積比例相當(dāng)。以每種提取方法3 次平行提取病毒RNA 為模板，每次用同種熒光RT-PCR 試劑進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，磁珠法提取核酸的熒光RT-PCR 結(jié)果成功率較高，3 次檢測(cè)，陽(yáng)性率均為100%。結(jié)果見(jiàn)表1。

從每種提取方法的3 次平行熒光RT-PCR 檢測(cè)中，各選取一張擴(kuò)增效果較好的曲線圖（見(jiàn)圖1、圖2），其中磁珠法提取核酸熒光RT-PCR 陽(yáng)性樣品的Ct 值范圍為13.46～29.81（陽(yáng)性對(duì)照Ct 值：19.70）；柱式法提取核酸熒光RT-PCR 陽(yáng)性樣品的Ct 值范圍為17.09～31.23（陽(yáng)性對(duì)照Ct 值：20.11）。

3 討論

3.1 磁珠法提取核酸的檢測(cè)靈敏度較高

表1 兩種提取方法檢測(cè)新城疫熒光RT-PC R陽(yáng)性率的比較

圖1 磁珠法提取核酸熒光RT-PCR 擴(kuò)增曲線

圖2 柱式法提取核酸熒光RT-PCR 擴(kuò)增曲線

根據(jù)表1，對(duì)于22 份新城疫陽(yáng)性待檢樣品，磁珠法提取核酸的熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果全部為陽(yáng)性，檢出率達(dá)100%，而柱式法提取核酸的熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果較好的一次，檢出率僅達(dá)86.36%（19/22）；由圖1 和圖2 可知，磁珠法提取核酸的熒光RT-PCR 擴(kuò)增曲線較好，反映出所提取核酸的濃度及純度較高。這表明磁珠法提取核酸的檢測(cè)靈敏度較高。對(duì)于檢測(cè)一些病毒含量較低的樣品而言，選擇磁珠法提取核酸，可以避免因核酸提取效率低導(dǎo)致熒光RT-PCR 結(jié)果假陰性的出現(xiàn)，能夠減少新城疫疫情診斷的失誤。

3.2 磁珠法提取核酸的檢測(cè)重復(fù)性較好

由表1 可知，3 次平行檢測(cè)，磁珠法提取核酸的熒光RT-PCR檢出率均為100%，檢測(cè)結(jié)果一致。這表明磁珠法提取核酸的檢測(cè)重復(fù)性較好。究其原因，應(yīng)該與磁珠法提取原理及用機(jī)器代替人工進(jìn)行全自動(dòng)操作有關(guān)。在提取過(guò)程中磁珠的大表面積與目標(biāo)核酸特異性地識(shí)別和高效結(jié)合，使其具有優(yōu)越的洗脫效率，可有效提高提取核酸的濃度及純度。

3.3 加強(qiáng)磁珠法在新城疫病毒核酸提取中的應(yīng)用

做好新城疫監(jiān)測(cè)工作，可為新城疫疫情預(yù)警預(yù)報(bào)提供有效技術(shù)支撐，是現(xiàn)階段降低新城疫流行的重要手段。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，磁珠法提取核酸在新城疫的熒光定量檢測(cè)中優(yōu)于柱式法。在當(dāng)前普遍采用熒光RT-PCR 檢測(cè)方法的背景下，選擇提取效率較高的核酸提取方法，可有效保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此建議各獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)磁珠法在新城疫病毒核酸提取中的應(yīng)用。