應用環境DNA 技術對邵伯湖浮游動物物種檢測的初步研究

唐晟凱，錢勝峰，沈冬冬，張彤晴，劉燕山，許飛，王華，李大命

（1.江蘇省淡水水產研究所，江蘇省內陸水域漁業資源重點實驗室，江蘇 南京 210017；2.江蘇省高寶邵伯湖漁業管理委員會辦公室，江蘇 揚州 225009）

引言

在水體生態環境中，水生生物通過新陳代謝向水體中釋放DNA。“環境DNA 技術”是環境DNA 宏條形碼技術的簡稱，是通過從環境介質中提取DNA，對樣本片段進行生物測序，進而了解環境中的生物群落分布情況[1-3]。環境DNA 技術最早應用于微生物學研究，近年來逐步被應用于水生生物的監測[4-13]，但目前該技術在湖泊浮游動物物種檢測方面的應用仍然較少。

邵伯湖位于江蘇省揚州市，與高郵湖和寶應湖共同組成高寶邵伯湖，屬淮河入江水道上的湖泊之一，在漁業生產、蓄洪、農業灌溉等方面具有重要作用。在2016 年的調查中，邵伯湖的浮游動物共計有12 科16 屬20 種[14]。該研究運用環境DNA 技術對邵伯湖浮游動物進行資源監測，一方面為邵伯湖漁業資源與水生生物資源保護提供了基礎數據，同時也探索了在淺水湖泊進行浮游動物監測的新方法。

1 材料與方法

1.1 采樣點位設置

在全湖設置了15 個采樣點，其中北部敞水區、中部敞水區和南部河道區各設置了4 個、5 個和6個采樣點。采樣點位置分布見圖1。

1.2 采樣及樣品前處理

樣品采集于2018 年11 月7 日。在每個采樣點，用無菌聚丙烯瓶（Thermo；US）采集2 L 表層水（在水面以下約20 cm 處采集），現場用0.8 μm 孔徑的混合纖維濾膜（易基諾；南京）過濾。過濾后的濾膜置于-20 ℃冰箱，冷凍保存，直到DNA 提取。

1.3 DNA 提取

使用DNeasy Power Water Kit（QIGEN；Germany）提取濾膜DNA，具體操作如下：將濾膜置于帶有研磨珠的5 mL 離心管內，加入1 mL 的55 ℃PW1，均質5 min，全部吸取并離心1min；取上清加入200 μL IRS，渦旋混勻后于4 ℃靜置5 min，離心1 min；取上清加入650 μL PW3，混勻后過MB Spin Column富集DNA；分別加650 μL PW4 和650 μL 乙醇清洗，用100 μL EB 洗脫。使用Nano Drop 2000 測定DNA濃度和純度，并于-20 ℃冷凍存儲。

圖1 采樣點位置

1.4 PCR 擴增

利用線粒體DNA 12S rRNA 引物進行PCR 擴增，PCR 擴增體系：總體系50 μL，包含2X Phusion Master Mix with HF Buffer 25 μL（Thermo；US），上下游引物各2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O19 μL；擴增條件：98 ℃預變性30 s，98 ℃變性10 s，66 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s。以ddH2O 為模板設置PCR 陰性對照。PCR 產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進行條帶檢測，PCR 陰性對照擴增結果為陰性。使用AMPure XP（Beckman Coulter; US）磁珠純化PCR產物。

1.5 高通量測序及數據分析

使用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent 試劑盒（NEB；US）構建二代測序文庫后，Agilent 2100 檢測DNA 文庫質量，稀釋DNA 文庫至100 pmol/L，利用Ion Proton 測序儀進行樣品的二代測序。二代測序數據下機后，數據分析全部基于ubuntu 14.04 版本下的EcoView 軟件。

2 結果與分析

2.1 環境DNA 濃度與PCR

環境DNA 濃度介于17.3 至179.3 ng/μL 之間，平均濃度54.25 ng/μL；DNA 樣本的260/280 介于1.74 至1.93 之間，平均值1.83；DNA 樣本的260/230介于0.98 至2.13 之間，平均值1.54。其中，82 個樣本（94.44%）的DNA 濃度＞20ng/μL；87 個樣本（100.00%）的260/280 介于1.8 至2.0 之間，87 個樣本（94.44%）的260/230 介于1.8 至2.0 之間（圖2）。

圖2 樣本DNA 濃度及260/280

2.2 物種檢測

該次測序共獲得邵伯湖1 114 482 條DNA 序列（Reads 數），DNA 片段長度約為380 bp。15 個采樣點均獲得DNA 序列信息測序數據共聚類形成646 個OTUs，注釋出的浮游動物共有68 個OTUs，隸屬于5 目14 科18 屬22 種（圖3），其中鰓足綱共有26 個OTUs ，包括1 目6 科7 屬8 種，象鼻溞科、溞科、粗毛溞科、裸腹溞科和仙達溞科各1 種，薄皮溞科2 種；甲殼綱共有17 個OTUs，包括2 目2 科3 屬3 種；單巢綱共有25 個OTUs，包括2 目6科8屬11 種，聚花輪科、三肢輪科、晶囊輪科、疣毛輪科和鼠輪科各1 種，臂尾輪科6 種。在國內外研究工作者的基礎上，根據浮游動物的大小、攝食習性以及浮游動物之間的相互作用，將淡水生態系統浮游動物劃分為原生動物濾食者PF、原生動物捕食者PC、輪蟲濾食者RF、輪蟲捕食者RC、小型浮游動物濾食者SCF、小型浮游動物捕食者SCC、中型浮游動物濾食者MCF、中型浮游動物捕食者MCC、大型浮游動物濾食者LCF 和大型浮游動物捕食者LCC 10 個浮游功能群[15]（表1）。根據淡水浮游動物功能群分類將邵伯湖22 種浮游動物分為RF（9 種）、RC（1 種）、SCF（5 種）、SCC（1 種）、MCF（1種）、MCC（2 種）、LCF（1 種）和LCC（2 種），分別占總種類數的40.91%、4.55%、22.73%、4.55%、4.55%、9.09%、4.55%和9.09%。Reads 數占比較高的物種為脆弱象鼻溞（47.79%），透明薄皮溞（20.24%），球狀許水蚤（16.10%）等（圖4）。邵伯湖浮游動物種類組成見表2。

圖3 邵伯湖浮游動物OUTS 數量圖

表1 淡水浮游動物功能群分類

功能群 縮寫 大小/mm 攝食習性大型浮游動物濾食者Large copepods filter feeders LCF ＞1.5 濾食者，以細菌、藻類、有機質和原生動物為食Large copepods carnivore LCC ＞1.5 捕食者，以輪蟲、枝角類、雙翅目昆蟲（搖蚊幼蟲）、寡毛類為食大型浮游動物捕食者

表2 邵伯湖浮游動物種類組成

圖4 邵伯湖浮游動物Reads 數占比組成圖

2.3 α 多樣性

如表3 所示，各樣點shannon 指數變化范圍為1.9433～4.8113，最小值出現在YZ-8，最大值出現在YZ-9。YZ-8 的各項指數均普遍低于其他點位，表明其浮游動物多樣性程度較低；YZ-9 的各項指數均普遍高于其他點位，表明其浮游動物多樣性程度較高。

表3 邵伯湖各采樣點位浮游動物α 多樣性指數表

2.4 β 多樣性

如表4 所示，各樣點Bray-Curtis、Hellinger、Unweighted unifrac、Weighted unifrac 的最大值普遍出現在YZ-9 和YZ-11，由于不同群落或某環境梯度上不同點之間的浮游動物共有種越少，β 多樣性越大[15]。YZ-9 和YZ-11 的各項指數均顯著高于其他點位，與其他點位共有物種較少。

3 討論

3.1 浮游動物物種檢測

該研究監測到浮游動物14 科18 屬22 種，其中有16 種注釋到“種”，6 種注釋到“屬”。在2016 年的調查中，邵伯湖浮游動物共計12 科16 屬20種[14]。與該次調查結果相比，粗毛溞、秀體溞屬、中劍水蚤屬、三肢輪屬、晶囊輪屬、臂尾輪屬、龜甲輪屬、多肢輪屬和異尾輪屬相同，兩次調查均為單巢綱種類最多，其次為鰓足綱，甲殼綱最少；與該次調查相同種類僅有1 種，為萼花臂尾輪蟲；該次調查較2016 年的調查多2 科2 屬2 種。

與2016 年調查種類上有所差異可能是由于：①調查點位的設置不同。該次調查設置的點位較均勻地分布于全湖且點位較多，而2016 年調查設置的點位多位于岸邊。②調查的頻次與季節不同。該次調查為1 個頻次，2016 年調查為1 月、5 月和9月共3 個頻次。③調查方法的差異。與傳統調查方法相比，利用環境DNA 技術對浮游動物進行鑒定更具客觀性，而運用傳統的鏡鑒方法進行物種鑒定（如2016 年的調查）則主觀性更強。當然，現階段的環境DNA 技術在某些方面仍然存在一些不足[16-22]，因此在現階段的浮游動物物種檢測中，環境DNA 技術尚難以完全取代傳統方法。

表4 邵伯湖各采樣點位浮游動物β 多樣性指數

該研究中，薄皮溞sp.，中劍水蚤sp.，擬聚花輪蟲sp.，三肢輪蟲sp.，晶囊輪蟲sp.及臂尾輪蟲sp. 等6 種浮游動物的DNA 序列未注釋到“種”的水平，原因可能在于選擇的12S rRNA 標志基因保守性較大，對近緣物種的辨識度不夠。因此將來運用環境DNA 技術對浮游動物進行物種檢測時，擴增引物還需進一步優化。

3.2 邵伯湖浮游動物功能群分布分析

該研究發現邵伯湖浮游動物功能群以輪蟲濾食者RF 的輪蟲為主，大型浮游動物幾乎缺失，浮游動物顯著小型化，這可能主要是由于近年來水體魚類資源量下降，大型魚類尤其是肉食性魚類持續減少，主要以小型魚類為主，而小型魚類對枝角類和橈足類等浮游動物攝食壓力顯著[23]。影響浮游動物功能群分布的因素有很多，溫度、營養鹽、浮游植物的上行效應、魚類攝食的下行效應、種間競爭等是影響浮游動物生長的主要因素[24-25]。因此，浮游動物的動能群的分布，也可以反映出生態環境的整體狀況，利用環境DNA 技術對浮游動物進行調查，能為水體生態環境評價提供參考。

3.3 邵伯湖浮游動物多樣性分析

各樣點Shannon 指數變化范圍為1.9433-4.8113，最小值出現在YZ-8，最大值出現在YZ-9。YZ-8 的α 多樣性各項指數均顯著低于其他點位的原因較多，可能是因其處在邵伯湖多個支流匯集處而導致流速過大有關，也可能與該點位的水質狀況有關。其他樣點α 多樣性的各項指數較為均勻，表明邵伯湖浮游動物生態結構較為均衡和穩定。

邵伯湖的β 多樣性的各項指數顯示最大值均出現在YZ-9 和YZ-11，與其他樣點共有物種較少，YZ-9 和YZ-11 共有物種較少可能與樣點的生態環境有關，溫度、營養鹽、浮游植物的上行效應、魚類攝食的下行效應、種間競爭等是影響浮游動物生長的主要因素[24-25]。各樣點共有物種較為集中，表明邵伯湖浮游動物的生態結構較為均衡，空間分布上較為均勻。

3.4 環境DNA 技術在湖泊浮游動物資源監測中的應用前景

環境DNA 技術為淡水浮游動物資源監測、物種多樣性評價等提供了新的方法，具有廣闊的應用前景。相比傳統的監測方法，運用環境DNA 技術監測浮游動物具有以下主要優勢：不依賴物種鑒定專家，減少了物種鑒定中的主觀差異；靈敏度高，對較為稀有種類的監測效果較好；可大批量檢測樣品，比傳統的物種鑒定節約時間與人力。但運用環境DNA 技術進行浮游動物資源監測仍存在一些局限，如缺乏技術規范、少數近緣物種因序列相似而難以區分以及無法反映浮游動物的生理狀態、生長發育階段等生物學特征等。

因此，在現階段的淡水浮游動物資源監測中，可根據監測任務的需要，將環境DNA 技術與傳統的監測方法結合使用。

4 結論

在應用環境DNA 技術對邵伯湖浮游動物資源的監測中，共檢出浮游動物22 種，邵伯湖浮游動物功能群以輪蟲濾食者RF 的輪蟲為主，大型浮游動物幾乎缺失，浮游動物顯著小型化，預示了邵伯湖魚類可能正趨于小型化；各樣點浮游動物的α 多樣性各項指數和β 多樣性各項指數差異較小，表明邵伯湖浮游動物的生態結構較為穩定。環境DNA 技術適用于淺水湖泊浮游動物群落監測，在現階段的淡水浮游動物資源監測中，該技術宜與傳統的監測方法結合使用。