從網絡藥理學角度探究骨碎補治療骨折類疾病的作用機制

張來福，盧承印，王孝輝，武愛玲

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州450046；2.河南省洛陽正骨醫院/河南省骨科醫院，河南 洛陽 471002)

骨折以交通傷害為首要致病因素[1]。骨折不愈合時不僅影響患者的身體健康，還會造成心理問題，降低患者生活質量[2]。因此如何促進骨折愈合，降低骨折對患者的影響成為治療的關鍵。在固定斷骨的同時，配合促進骨痂生長的藥物是臨床治療骨折的常用手段[3-4]。在傳統醫學中，有諸多促進骨折愈合的中草藥，如骨碎補、杜仲、續斷等[5]。臨床也常用含有骨碎補的方劑治療骨折[6-7]，并取得了較好的療效，但骨碎補促進骨折愈合的作用機制仍未完全明確。

中藥骨碎補(Rhizoma drynariae)是水龍骨科植物槲蕨(Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.)根莖的加工品，味苦性溫，歸肝腎經，具有療傷止痛、補腎強骨、消風祛斑的功效，臨床常用于跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動、外治斑禿、白癜風的治療[8]。《素問·宣明五氣篇》中指出“腎主骨，肝主筋”。《備急千金要方》一書也提到“腎應骨，骨與腎合”“肝應筋，筋與肝合”的相關理論。《素問·陰陽應象大論篇》中云：“腎生骨髓，在體為骨”，說明腎主骨生髓，骨是人體的支架。在骨折治療時，若腎生骨髓不足，則骨無以養、骨難愈合[9]。因此，在骨折的治療中須配合補腎強骨之法。

網絡藥理學是將化學基因組學與網絡藥理生物學相結合的新學科，2007年首次被Hopkins AL[10]提出，旨在構建“藥物-靶基因-疾病”網絡，從整體上分析藥物成分與疾病中多成分、多靶基因、多通路的關系，從而揭示藥物治療疾病中潛在的有效成分、作用靶基因及通路。本文通過網絡藥理學的方法構建“骨碎補-活性成分-靶基因-骨折”的調控網絡(詳細研究步驟見圖1)，研究骨碎補治療骨折的作用機制。

圖1 網絡藥理學研究骨碎補促進骨折愈合作用機制步驟

1 分析方法

1.1 骨碎補有效成分篩選

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine system pharmacology，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)是根據中草藥系統藥理學的框架建立，用于藥物篩選和評估，可以提供中草藥活性成分及其對應的靶基因、目標疾病等信息[11]。在TCMSP中檢索骨碎補活性成分及對應靶基因，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似度(Drug-likeness，DL)≥0.18的條件進行篩選[12]，結果共得到18種活性成分及其各自對應靶基因(見表1)。利用軟件perl(https：//www.perl.org/)和基因庫Uniprot(https：//www.uniprot.org/)為靶基因進行注釋得到基因名，并排除無法找到基因名的靶基因。

1.2 骨折對應靶基因篩選

以骨折(fracture)為關鍵詞分別在GeneCards(https：//www.genecards.org/)和OMIM(https：//www.omim.org/)數據庫中搜索相關靶基因。

1.3 篩選骨碎補-骨折對應靶基因的交集

利用軟件R(https：//www.r-project.org/，版本3.6.1)對骨碎補與骨折靶基因取交集，得出骨碎補-骨折共同靶基因的venny圖(見圖2)，并從中得到骨碎補-骨折的靶基因列表。

1.4 構建“骨碎補-活性成分-共同靶基因-骨折”調控網絡

利用軟件perl和Cytoscape(https：//cytoscape.org/，版本3.7.2)對骨碎補、有效活性成分、骨折、共同靶基因進行計算畫圖，得到“骨碎補-活性成分-骨折-共同靶基因”的調控網絡(見圖3)。

1.5 構建“骨碎補-骨折共同靶基因”蛋白相互作用網絡(protein-protein interaction network，PPI網絡)，篩選核心靶基因

將“骨碎補-骨折靶共同基因”輸入軟件STRING(https：//string-db.org/cgi/input.pl)，同時以人類(Homo sapiens)為選擇條件，以0.4為最小互作分數，得到相應結果(圖4)。并將結果輸入R軟件中，進而得到PPI網絡核心靶基因圖(圖5)。

1.6 GO功能富集分析

GO(Gene Ontology)分析通過在數據庫(org.Hs.eg.db)中對基因進行細胞成分、生物學過程、分子功能三部分的描述，進而得到基因的注釋信息，通過比較得到差異表達基因，進一步得到GO富集分析。將“骨碎補-骨折共同靶基因”輸入軟件R，利用相應腳本得到GO功能富集分析圖(圖6)。以P<0.05為差異具有統計學意義。

1.7 KEGG通路富集分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通過將生物體內所有通路進行富集分析，檢測目標基因是否在某類通路中富集而得到的結果。將“骨碎補-骨折共同靶基因”輸入軟件R，利用相應腳本得到KEGG通路富集分析圖(圖7、圖8)。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨碎補有效活性成分篩選

依據上述標準進行篩選，結果共得到18種活性成分和304個對應靶基因。見表1。

表1 根據OB和DL參數在TCMSP數據庫中對骨碎補活性成分篩選結果

2.2 骨碎補-骨折對應的靶基因交集

在軟件R中利用腳本對骨碎補與骨折靶基因取交集，得出骨碎補-骨折共同靶基因的venny圖及共同靶基因列表。其中骨折對應相關靶基因有3 490個，骨碎補對應靶基因有77個，骨碎補-骨折共同靶基因有55個。

圖2 骨碎補-骨折靶點

2.3 “骨碎補-活性成分-骨折-共同靶基因”調控網絡

從圖3中得知骨碎補有14種活性成分，分別為：柚皮素((2R)-5，7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-chroman-4-one)、金魚草素(Aureusidin)、豆甾醇(Stigmasterol)、去甲異辛醇(黃烷酮)(Eriodyctiol (flavanone))、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、柚皮苷(naringenin)、(+)兒茶素((+)-catechin)、圣草素(eriodictyol)、木犀草素(luteolin)、22-豆甾烯-3-酮(22-Stigmasten-3-one)、環木菠蘿烯酮(cycloartenone)、大蒜素(davallioside A_qt)、黃姜烯醇(xanthogalenol)。其中圣草素OB最高，為71.79%；環木菠蘿烯酮DL最大，為0.79；活性成分連接靶基因最多的是山奈酚、木犀草素，分別連接26、25個靶基因。在骨碎補治療骨折的過程中，可能通過這14種有效成分作用于55個共同靶基因促進骨折愈合。

注：圖中部分代表藥物骨碎補，部分代表疾病骨折，部分為骨碎補中活性成分，部分為靶點。

2.4 “骨碎補-骨折靶基因”PPI網絡

圖4中每個節點代表一個基因片段，節點內填充為基因形狀(未填充為基因片段形狀未明確)。連線代表節點之間的相互作用，節點連線越多則代表成為核心基因的概率越大。圖中共有407條連線，其中互作分數最高的為IKBKB-NFKBIA、CASP7-CASP8、CASP8-CASP3、NCOA2-AR四條連線，互作評分均為0.99。

圖4 骨碎補-骨折PPI網絡

2.5 PPI網絡核心靶基因

柱狀圖清晰顯示節點連線多少，自下至上節點連線依次減少，其中IL-6(白介素-6)最多，有39條連線，其次是EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生長因子受體)和VEGFA(vascular endothelial growth factor A，血管內皮生長因子A)，均為33條。

2.6 GO功能富集圖

共同基因共得到73種功能富集，部分核心基因功能富集結果見圖6。由圖中得知，功能富集程度最高的分別為類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity，8個基因)、核受體活性(nuclear receptor activity，7個基因)、轉錄因子活性(transcription factor activity)、類固醇結合(steroid binding，7個基因)、參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process，7個基因)。因此骨碎補在治療骨折類疾病時，可能是14種有效成分作用于55個共同靶基因通過調控上述受體活性發揮作用。

注：該圖左列為基因名稱，數字表示與鄰近節點的連線多少。

注：左列為對應的GO號；數字代表基因富集數目；P值表示富集程度高低，P值越小、顏色越深，表示富集程度越高。

2.7 KEGG通路富集分析

共得到101條KEGG通路，取部分通路作圖，結果見圖7、圖8。由圖中得知，通路富集程度最高的分別為前列腺癌(Prostate cancer)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)等通路。因此骨碎補在治療骨折類疾病時，可能是14種有效成分作用于55個共同靶基因通過上述通路對73種受體活性發揮調控作用。

圖8是標注節點后的通路圖，其中每個節點代表一個蛋白、酶或基因，箭頭代表上下游之間的作用關系，紅色標注的節點表示出現在調控網絡中，未進行標注的節點表示未曾出現在調控網絡中。

3 討論

在中醫理論中，腎藏精、主骨、生髓，腎精盛衰決定骨骼的生長速度，因此在治療骨折類疾病時，當以補腎強骨為要，而骨碎補為補腎強骨要藥，在臨床有很多骨碎補促進骨折愈合的報道[13-14]。在筆者前期研究中[15]，也證實了骨碎補的提取物骨碎補總黃酮能促進大鼠誘導膜中血管內皮生長因子(VEGF)和骨形態發生蛋白-2(BMP-2)的表達，而VEGF能促進微小血管增生，BMP-2誘導成骨能力強，VEGF和BMP-2表達的增加可加速促進骨折愈合。骨折愈合通常經歷三個階段：炎癥階段、修復階段、細胞重塑階段。骨骼損傷后會引發炎癥反應、形成血腫，隨后到達修復階段形成軟骨愈傷組織、礦化，最后經過成骨細胞和破骨細胞的作用進行重塑，恢復骨骼結構[16-18]。

注：左列表示通路名稱；下行數字表示通路上基因富集數目；P表示富集程度，其中P越小、顏色越深表示富集程度越高。

注：左上角為通路名稱Prostate cancer，該通路中共有13個不同基因富集。

本研究結果表明，骨碎補在治療骨折類疾病時共有14個有效活性成分，其中鄰近節點連線最多的是山奈酚和木犀草素。據文獻報道，山奈酚不僅能誘導細胞對抗腫瘤藥物的耐受作用[19]，而且具有抗癌、抗心血管疾病、抗炎、抗糖尿病、促進骨折愈合、抗血小板聚集等作用[20]。促進骨折愈合的作用中，山奈酚能改善細胞活力，通過提高堿性磷酸酶(ALP)的活性促進成骨基因的表達，通過誘導自噬進而促進成骨細胞的分化、增殖、礦化[21]，同時具有抑制破骨細胞骨吸收的作用[22]。木犀草素具有抗腫瘤[23]、抗炎[24]、抗衰老[25]等作用。尚丹等[26]研究發現木犀草素能促進成骨細胞的增殖、分化、礦化；Quan He等[27]也發現木犀草素能促進人體成骨細胞的分化；Lucía等[28]證實木犀草素能通過促進ALP的合成進而有利于成骨細胞的分化。Kim等[29]證實木犀草素可抑制破骨細胞的分化和成熟破骨細胞的吸收活性。OB最高的圣草素能通過抑制NFATc1活性抑制RANKL誘導的破骨細胞的形成和骨吸收[30]；而DL最大的環木菠蘿烯酮尚缺乏有效研究。因此骨碎補促進骨折愈合是山奈酚、木犀草素等多種有效成分共同發揮作用的結果。

在PPI網絡中，骨碎補活性成分-骨折對應的共同靶基因IL-6、EGFR、VEGFA是連線最多的節點。其中IL-6可刺激淋巴細胞和巨噬細胞進入骨折部位，對于骨折的愈合起著重要作用[31]。EGFR及其信號通路對調控成骨細胞、破骨細胞增殖、分化具有重要的生物學作用[32]。高水平的VEGFA有助于促進骨折愈合及功能恢復[33]。因此骨碎補促進骨折愈合是IL-6、EGFR、VEGFA等多核心基因共同調節的結果。

在GO功能富集中，富集程度最高的分別為類固醇激素受體活性、核受體活性、轉錄因子活性等。類固醇激素受體是包括雌激素受體、雄激素受體、糖皮質激素受體在內的一類受體[34]。雌激素和雄激素在骨形成中不可或缺，研究表明[35]，雌激素能通過調控成骨細胞和破骨細胞的活性，對骨量和骨骼強度的調節產生關鍵作用。也有研究[36-37]表明雌激素通過延長成骨細胞的壽命和縮短破骨細胞的壽命發揮作用，且雌激素的缺乏會影響骨折早期的炎癥反應和骨折的愈合。雄激素能通過影響成骨細胞、骨細胞的表達，骨轉換標記、骨小梁的變化等多方面因素影響骨生長、骨形態以及骨重建，對骨骼生長發育和維持骨量發揮著重要作用[38]。糖皮質激素不僅對炎癥性骨科疾病有治療作用，而且能通過影響骨髓細胞、破骨細胞、間充質細胞、軟骨細胞、成骨細胞的功能對骨折患者發揮治療作用[16，39]。核受體是包含雌激素、雄激素、糖皮質激素在內的超家族，同樣對骨折的愈合發揮調控作用[40]。

KEGG通路富集的結果顯示，富集程度最高的為前列腺癌通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、TNF信號通路等。每條通路中都包含多個共同靶基因，以富集程度最高的前列腺癌通路為例，其中有13個骨碎補活性成分-骨折共同對應的靶基因，這些基因對應的功能富集包含類固醇激素受體活性、核受體活性等在內的多種功能活性。在標注節點通路圖中可以發現，前列腺癌通路中包含PI3K-Akt、Apotosis、p53、MAPK等信號通路；流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路包括MAPK、NF-κB、PI3K-Akt等信號通路；TNF通路包括MAPK、PI3K-Akt、Apotosis、NF-κB等信號通路。MAPK、PI3K-Akt、NF-κB等信號通路均能參與炎癥反應階段，有效控制促炎性細胞因子的釋放[41]，MAPK也能參與調控成骨細胞的凋亡[42]；PI3K-Akt活性的抑制進一步影響成骨細胞的增殖[43]；NF-κB與細胞的增殖、生長分化等密切相關[44]，也參與成骨細胞的分化及基因的表達[45]。

綜上所述，在骨碎補治療骨折的過程中，通過山奈酚、木犀草素等有效成分作用于IL6、EGFR、VEGFA等共同靶基因，通過前列腺癌通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、TNF等信號通路調控類固醇激素受體、核受體、轉錄因子等受體活性發揮作用。本研究從微觀水平上揭示了骨碎補促進骨折愈合的機理，這也符合中醫理論中的整體觀念。中藥治療疾病中是多成分、多靶點共同發揮作用，經過人體機能統一調控的結果。