黃芪總皂苷對缺氧性肺動脈高壓作用探討

李旭東，馬勇，鄧潤鵬，蒼雪玉，吳飛燕，李永濤，金海峰

目前，世界衛生組織將肺動脈高壓分為動脈性肺動脈高壓、與左心疾病相關的肺動脈高壓、缺氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）、由肺動脈阻塞引起的肺動脈高壓、未知和（或）多因素所致肺動脈高壓5個亞類。研究顯示，肺部疾病和（或）長期低氧造成的肺部持續性低氧狀態可引起HPH［1］。HPH的病理特點是肺動脈的病理性重構及肺動脈壓力的升高，進而導致右心室壓力的超負荷，甚至右心室衰竭［2］。目前，臨床尚缺乏有效治療HPH的藥物。黃芪（astragali radix）為傳統中草藥，其有效藥用成分是黃芪總皂苷（astragaloside，AST）、多糖及黃芪總黃酮［3?4］。柳濟成等［5］證實，黃芪注射液可通過調節大鼠肺組織中的內皮素?1和一氧化氮水平，治療大鼠HPH。然而，有關黃芪中最有效藥用成分之一的AST對HPH的治療作用及其可能機制的研究少見報道。本研究通過建立HPH模型大鼠并給予AST，研究其對HPH模型大鼠肺動脈壓力及肺動脈結構重建的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料AST［紫外分光光度法（UV）≥98%］購自上海源葉生物科技有限公司，批號：J30N9T76378。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司。兔抗還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（Nox2）多克隆抗體、兔抗Nox4單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗購自ABclonal Technology。小鼠抗α?平滑肌肌動蛋白（α?SMA）單克隆抗體、兔抗β?actin單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組28只SPF級雄性SD大鼠（體質量180～200 g，7周齡）購自齊齊哈爾醫學院實驗動物中心［實驗動物合格證號：SCXK（黑）2016?001?001］。大鼠按隨機數字表法 均 分為對照組、HPH組、HPH+AST15 mg/（kg·d）組（HPH+AST15組）、HPH+AST45 mg/（kg·d）組（HPH+AST45組）。采用間斷式常壓低氧建立大鼠HPH模型。HPH組、HPH+AST15組、HPH+AST45組大鼠置于10%O2體積分數的低氧箱中，低氧時間為18 h/d，持續28 d。AST利用DMSO配制成母液，用無菌生理鹽水進一步配制成終濃度為0.5%的DMSO，腹腔注射于HPH+AST15組和HPH+AST45組大鼠。HPH組大鼠腹腔注射同等體積的含有0.5% DMSO的生理鹽水。

1.2.2 血流動力學檢測實驗28 d后，各組大鼠行腹腔注射麻醉，并將充滿肝素的PE導管經大鼠右側頸靜脈插入到右心室，利用BL?420S生物信號采集與分析系統監測各組大鼠肺動脈壓力的指標右心室收縮壓力（right ventricle systolic pressure，RVSP）。

1.2.3 肺組織HE染色將大鼠肺組織剪成3 mm×3 mm的組織塊，并進行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等操作，再將組織塊切成4μm厚的切片，進行HE染色。利用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統進行觀察并測量肺動脈的血管總面積、中膜面積、外徑以及內徑。肺動脈厚度百分比（WT）=（外徑?內徑）/外徑×100%；肺動脈面積百分比（WA）=中膜面積/血管面積×100%。

1.2.4 右心室肥厚指標檢測游離出大鼠心臟，去除左、右心房，將心室分成右心室（right ventricle，RV）和左心室+室間隔（left ventricle plus septum，LV+S），并分別稱質量。計算右心室肥厚程度：RV/（LV+S）。

1.2.5 肺組織免疫熒光染色肺組織切片經脫蠟、復水、抗原修復、內源性過氧化物酶阻斷、血清封閉，行免疫熒光染色觀察α?SMA，DAPI行細胞核染色。利用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統測量α?SMA的光密度（OD）值，判斷肺動脈增生情況。

1.2.6 各組SOD、CAT及MDA水平檢測抽取大鼠頸外動脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，提取血清；取適量大鼠肺組織制成10%勻漿，12 000 r/min離心10 min，提取上清液。參照檢測試劑盒說明書，利用分光光度法檢測大鼠血清及肺組織中的SOD、CAT及MDA水平。

1.2.7 Western blot法檢測肺組織Nox2和Nox4蛋白提取大鼠肺組織總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白經SDS?PAGE電泳后轉移至PVDF膜，5%牛奶封閉。孵育一抗，Nox2（1∶1 000），Nox4（1∶1 000），β?actin（1∶3 000），4℃過夜，洗膜，室溫孵育辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶3 000）1.5 h，洗膜。利用ECL發光試劑盒，檢測大鼠肺組織中Nox2和Nox4蛋白表達變化。實驗重復4次。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD?t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AST對大鼠RVSP及右心室肥厚的影響與對照組比較，HPH組大鼠RVSP和RV/（LV+S）均升高（P＜0.05）；與HPH組比較，HPH+AST15組和HPH+AST45組 大 鼠RVSP和RV/（LV+S）均 降 低（P＜0.05），HPH+AST15組和HPH+AST45組RVSP和RV/（LV+S）差異無統計學意義，見表1。

Tab.1 RVSP and RV/(LV+S)in the four rat groups表1 各組大鼠RVSP和RV/（LV+S） （n=7，x±s）

2.2 AST對大鼠肺動脈結構重建的影響大鼠肺組織HE染色及α?SMA免疫熒光染色結果顯示，與對照組比較，HPH組WT、WA及α?SMA水平均升高（P＜0.05）；與HPH組比較，HPH+AST15組和HPH+AST45組大鼠WT、WA及α?SMA水平均降低（P＜0.05），其中HPH+AST45組較HPH+AST15組WT、WA及α?SMA水平更低（P＜0.05），見表2，圖1、2。

Tab.2 Comparison of WT,WA andα-SMA OD value of pulmonary arteries between the four rat groups表2 各組大鼠肺動脈WT、WA及α-SMA情況比較（n=7，x±s）

2.3 各組肺組織及血清中SOD、CAT、MDA比較與對照組比較，HPH組肺組織和血清SOD和CAT水平均降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與HPH組比較，HPH+AST15組和HPH+AST45組肺組織和血清SOD和CAT水平升高，MDA水平降低（P＜0.05）。HPH+AST45組肺組織MDA水平較HPH+AST15組更低（P＜0.05），而HPH+AST15組和HPH+AST45組血清中的SOD、CAT、MDA水平差異無統計學意義，見表3。

2.4 AST對大鼠肺組織中Nox2和Nox4蛋白表達的影響與對照組比較，HPH組肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與HPH組比較，HPH+AST15組和HPH+AST45組肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達水平降低（P＜0.05），而HPH+AST45組較HPH+AST15組Nox2和Nox4蛋白表達水平亦降低（P＜0.05），見表4、圖3。

Tab.3 Comparison of the SOD,CAT and MDA levels both in lung tissues and in serum between the four rat groups表3 各組大鼠肺組織及血清中的SOD、CAT、MDA水平比較 （n=7，x±s）

Tab.4 The protein levels of Nox2 and Nox4 in the different rat groups表4 各組大鼠肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達（n=4，x±s）

Fig.3 The protein levels of Nox2 and Nox4 in the different rat groups圖3 各組大鼠肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達

3 討論

黃芪作為我國傳統中草藥用于治療各種相關疾病已有上千年歷史［6］。AST是黃芪中皂苷類化合物的總提取物，目前已被證明其對心血管疾病、腦血管疾病、腎臟損傷、肝癌、肺纖維化、糖尿病等均具有治療作用［3，7］。本研究結果顯示，與對照組比較，HPH組大鼠RVSP、RV/（LV+S）、WT、WA及α?SMA水平均升高，表明HPH組大鼠出現明顯的肺動脈壓力升高、右心室肥厚、肺動脈的增生和結構重建，HPH+AST15組和HPH+AST45組大鼠RVSP、RV/（LV+S）、WT、WA及α?SMA水平較HPH組大鼠均明顯降低，證明AST能夠有效抑制大鼠HPH的病理進展。

在HPH的病理發展過程中，低氧誘導而過量產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）會導致肺動脈中層平滑肌細胞的過度增生，從而造成肺動脈結構重建、肺動脈管壁的增厚、管腔變狹小、肺動脈壓力的進行性升高以及右心室的肥厚［8］。研究顯示，在低氧條件下，生物體內的線粒體、NADPH氧化酶系統等會產生大量過氧化氫（H2O2）、超氧化物陰離子（O2·?）等ROS物質，這些物質會參與肺血管張力的改變、肺動脈內皮細胞的功能失調、肺動脈平滑肌細胞的過度增生等血管病變發展過程［9?10］。在促進肺動脈平滑肌細胞增生方面，ROS可作為第二信使激活磷脂酰肌醇3?激酶/蛋白激酶B（PI3K?Akt），絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節酶（MAPK?ERK）等與增殖相關的信號通路，從而在低氧誘導的平滑肌細胞過度增生過程中發揮著重要作用［11］。NADPH氧化酶包括7個亞型，肺組織主要表達Nox1、Nox2、Nox4及Nox5亞型［12］。其中，Nox2和Nox4在肺動脈內皮細胞、肺動脈中層平滑肌細胞以及肺動脈外膜成纖維細胞中均有表達，并且在ROS的產生過程中起著主導性作用［13］。為應對過量ROS對組織或細胞的損傷，機體分泌的SOD和CAT等抗氧化酶在清除過量ROS及調節氧化應激損傷中發揮著重要作用［14］。MDA為脂質過氧化反應的標志物，其水平可間接反映機體氧化應激的損傷程度。在HPH的病理發展過程中，長期低氧會造成機體抗氧化酶的功能失常及活性降低，從而導致清除ROS能力減弱，引起MDA水平升高。因此，在HPH的病理發展過程中，如何有效抑制低氧誘導的NADPH氧化酶活性，從而降低ROS的過量產生，并提高抗氧化酶活性，是防治HPH的有效方法。Ma等［15］研究顯示，在心肌缺血模型大鼠中，AST能夠通過提高大鼠體內SOD水平，降低MDA水平，從而抑制ROS對心肌細胞的損傷。另外，Qiu等［16］證實在高同型半胱氨酸血癥模型大鼠中，AST可通過降低大鼠血管ROS水平，并提高SOD和CAT水平，對血管內皮細胞具有良好的保護作用。本研究結果顯示，AST不但能夠有效提高SOD和CAT兩種抗氧化酶水平，降低MDA水平，而且能夠有效抑制低氧誘導的Nox2和Nox4兩種氧化酶在大鼠肺組織中的高表達，提示AST抑制大鼠HPH的病理進展可能是通過降低Nox2和Nox4的表達及改善SOD和CAT活性來實現的。另外，HPH+AST45組大鼠肺組織中的Nox2和Nox4蛋白表達水平和MDA水平均低于HPH+AST15組，證實AST在大鼠肺組織中降低氧化酶活性及抑制氧化損傷方面，高劑量作用效果更加顯著。

綜上所述，AST作為一種良好的抗氧化物質，可通過抑制體內的氧化應激損傷，對HPH模型大鼠肺動脈壓力的升高、肺動脈增生及結構重建產生良好的抑制作用。

Fig.1 HE staining of pulmonary arteries in the different rat groups(×400)圖1各組大鼠肺動脈HE染色（×400）

Fig.2 Theα-SMA immunofluorescence staining of pulmonary arteries in the different rat groups(×400)圖2各組大鼠肺動脈α-SMA免疫熒光染色（×400）