丹皮酚對IL?1β誘導HFLS?RA的保護作用及相關機制研究

李梅，歐大明，黃麗芳，謝立虎，張濟

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身炎癥性疾病，其特征性病理改變為慢性滑膜炎及滑膜組織增生，最終可致關節和骨骼破壞［1］。成 纖 維 樣 滑 膜 細 胞（fibroblast?like synoviocytes，FLSs）被認為是介導RA關節破壞的主要效應細胞，釋放多種細胞因子，在炎癥反應、滑膜增生、關節破壞等過程中起著重要作用。因此，滑膜組織中的FLSs是RA炎癥介質的主要來源，在RA的發病機制中起重要作用［2］。牡丹皮作為我國傳統藥用植物，其主要成分是丹皮酚（Paeonol），具有抗炎和保護心血管等多種生物功能［3］。有研究表明，丹皮酚對皮炎、關節炎和急性感染等疾病具有治療作用［4］。然而，丹皮酚對滑膜炎、RA的治療效果及其作用機制尚少見報道。本研究旨在分析丹皮酚對白細胞介素（IL）?1β誘導人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞（HFLS?RA）及膠原誘導型關節炎（CIA）小鼠的治療作用，為RA治療藥物的研發提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料丹皮酚購自國家食品藥品監督管理局，純度98%；IL?1β購自美國PeproTech公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒和腫瘤壞死因子（TNF）?α、IL?6酶聯免疫吸附測定試驗（ELISA）試劑盒購自南京逸飛雪生物科技有限公司；基質金屬蛋白酶（MMP）?1、MMP?3抗體購自武漢博斯特生物技術公司；Toll樣受體?4（TLR4）、anti?NF?κB p65、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗和Alexa Fluor 488偶聯的驢抗羊IgG二抗購自美國CST公司；RIPA裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑和增強化學發光（ECL）試劑均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Mini?PROTEAN電泳儀購自美國Bio?Rad公司；FC酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養HFLS?RA細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，采用DMEM培養基置于37℃、5%CO2培養箱中培養，添加10%胎牛血清，每2 d更換1次培養基。當HFLS?RA細胞生長至融合度為95%時，采用胰蛋白酶消化，以1∶4進行傳代，取第3～8代的HFLS?RA細胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測細胞存活能力將HFLS?RA細胞以密度1×104個/孔接種于96孔板中，實驗設空白對照組（未加IL?1β或丹皮酚處理），10μg/L IL?1β組（HFLS?RA經10μg/L IL?1β誘導）及0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚組（HFLS?RA經10 μg/L IL?1β誘導及0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚干預）。培養24 h后，加入25μL MTT溶液，37℃孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，振動篩上混勻15 min。采用酶標儀測量波長540 nm處的光密度（OD）值。

1.4 ELISA法測定細胞因子水平將HFLS?RA細胞以1×105個/mL接種至6孔板中，細胞分組同1.3，培養24 h，待細胞融合度約為80%時，吸取各組上清液，2 000 r/min離心20 min，置于無菌管中，?20℃保存；按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測HFLS?RA細胞中TNF?α、IL?6水平。

1.5 免疫熒光法觀察HFLS?RA中NF?κB p65細胞核移位將HFLS?RA細胞以1×105個/mL接種于培養皿，實驗設空白對照組（未加IL?1β或丹皮酚處理）、10μg/L IL?1β組（HFLS?RA經10μg/L IL?1β誘導培養30 min）及10μmol/L丹皮酚組（HFLS?RA經IL?1β誘導培養30 min后，加入10μmol/L丹皮酚作用1 h）。將HFLS?RA固定、滲透、加入anti?NF?κB p65一抗（稀釋比例1∶100）孵育過夜，然后用Alexa Fluor 488偶聯的驢抗羊IgG二抗（稀釋比例1∶600）孵育，進行DAPI，后進行激光共聚焦顯微鏡拍攝，采用ImagePro Plus 6.0軟件分析p65細胞核移位。

1.6 Western blot檢測MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白的表達將HFLS?RA細胞分為空白對照組，10μg/L IL?1β組，0.1、1、10μmol/L丹皮酚組以及陰性對照組，陰性對照組HFLS?RA未經IL?1β誘導，加入10μmol/L丹皮酚處理1 h，其余組處理方法同1.5。HFLS?RA經不同濃度丹皮酚預處理后，用預冷PBS清洗，添加RIPA裂解緩沖液，BCA法測定蛋白濃度并調至一致。將蛋白樣品和加樣緩沖液混合煮沸至變性，取等量（25μg）蛋白質進行10%～12.5%SDS?PAGE電泳，轉移至聚偏氟乙烯膜，用5%（W/V）脫脂牛奶封閉2 h，MMP?1（稀釋比例1∶1 000）、MMP?3（稀釋比例1∶500）、TLR4（稀釋比例1∶1 000）和GAPDH（稀釋比例1∶1 000）一抗4℃孵育過夜。隨后，TBST洗膜，用辣根過氧化物酶（HRP）結合的IgG二抗（1∶2 500）室溫孵育2 h，ECL化學發光試劑顯色，曝光成像。采用fluochem?HD2化學發光儀和AlphaView?SA軟件對譜帶光密度進行分析。

1.7 動物分組與處理24只雄性DBA/1小鼠，SPF級，體質量18～22 g，7～8周齡，購自桂林醫學院實驗動物中心，合格證號：SCXK桂2015?0012。動物在標準環境（24±1）℃下飼養，相對濕度（56±5）%，本研究方案經醫院動物倫理委員會審核批準。采用簡單隨機抽樣法將小鼠分為對照組、CIA組和治療組3組，每組8只。CIA組和治療組依據文獻［5］制作CIA小鼠模型，取500μL雞Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑按1∶1充分乳化，在大鼠尾根部皮下注射0.1 mL乳劑，初次免疫當天作為第0天，第7天按上述方法、相同劑量（0.1 mL/只）加強1次；對照組僅注射等體積的生理鹽水；治療組小鼠造模成功后，于第10～48天每隔1天灌胃10 mg/kg丹皮酚。分別于第0、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48天觀察小鼠臨床癥狀，并根據大鼠每個關節的病變程度進行累計積分（四肢累計評分）。四肢評分標準［6］，0分：無關節炎；1分：有紅色斑點或輕度腫脹；2分：關節部位中度腫脹；3分：嚴重腫脹；4分：嚴重腫脹且不能負重。四肢累計評分≥4分，視為造模成功。在初次免疫后第48天，采用戊巴比妥（90 mg/kg）麻醉小鼠實施安樂死。

1.8 HE染色觀察關節組織病理學改變初次免疫后第48天，處死小鼠后取踝關節滑膜組織，用4%多聚甲醛固定，隨后用10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，石蠟包埋，制作5μm厚切片，行常規HE染色，進行組織學觀察。

1.9 ELISA法測定大鼠滑膜組織中炎性因子水平各組小鼠處死后，無菌條件下，鈍性分離踝關節周圍的肌腱、韌帶和脂肪組織等，剝離滑膜組織，按照質量（g）∶體積（mL）1∶9加入預冷的生理鹽水，制成10%勻漿液，機械勻漿，2 000 r/min離心20 min，吸取上清液保存。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測小鼠滑膜組織中TNF?α、IL?1β水平。

1.10 統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，計量資料以x±s表示，不同時點各組間比較采用重復測量設計的方差分析；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測HFLS?RA細胞增殖情況與空白對照組比較，10μg/L IL?1β可促進HFLS?RA細胞增殖（P＜0.05）；與10μg/L IL?1β組比較，0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚對IL?1β誘導HFLS?RA細胞增殖無明顯抑制作用（P＞0.05），見圖1。

Fig.1 Effects of paeonol on IL?1βinduced cell proliferation in HFLS?RA圖1 丹皮酚對IL?1β誘導HFLS?RA細胞增殖的影響

2.2 ELISA法檢測HFLS?RA細胞中TNF?α、IL?6水平10μg/L IL?1β組TNF?α、IL?6水平明顯高于空白對照組（P＜0.05）；0.1、1、10、100μmol/L丹皮酚組TNF?α、IL?6水平均低于10μg/L IL?1β組（P＜0.05）；1、10μmol/L丹皮酚組TNF?α水平低于0.1 μmol/L丹皮酚組（P＜0.05），100μmol/L丹皮酚組TNF?α水平與0.1、1、10μmol/L丹皮酚組差異均無統計學意義；0.1、1、10μmol/L丹皮酚組IL?6水平依次降低（P＜0.05），100μmol/L丹皮酚組IL?6水平低于0.1μmol/L丹皮酚組，高于10μmol/L丹皮酚組（P＜0.05），與1μmol/L丹皮酚組差異無統計學意義，見圖2。

Fig.2 The concentration of TNF?αand IL?6 in cell supernatant between groups圖2 各組細胞上清液中TNF?α、IL?6水平比較

2.3 免疫熒光法觀察NF?κB p65核移位情況10μg/L IL?1β組HFLS?RA中NF?κB p65核移位陽性表達水平明顯高于空白對照組和10μmol/L丹皮酚組（P＜0.05），見圖3、4。

2.4 Western blot法檢測MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白的表達10μg/L IL?1β組MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達水平明顯高于空白對照組（P＜0.05）；0.1μmol/L丹皮酚組MMP?1、MMP?3和TLR4

Fig.4 Effects of paeonol on nuclear translocation of NF?κB p65 in HFLS?RA圖4 丹皮酚對HFLS?RA中NF?κB p65核移位的影響

蛋白表達水平與10μg/L IL?1β組差異無統計學意義，1、10μmol/L丹皮酚組MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達水平低于10μg/L IL?1β組（P＜0.05）；1 μmol/L丹皮酚組MMP?1、MMP?3蛋白表達水平低于0.1μmol/L丹皮酚組（P＜0.05），TLR4蛋白表達水平與0.1μmol/L丹皮酚組差異無統計學意義；10 μmol/L丹皮酚組MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達水平低于1μmol/L丹皮酚組，高于陰性對照組（P＜0.05），見圖5、6。

Fig.5 The protein expressions of TLR4,MMP?1 and MMP?3 in HFLS?RA detected by Western blot assay圖5 Western blot法檢測HFLS?RA中TLR4、MMP?1和MMP?3蛋白表達

2.5 各組小鼠四肢累計評分比較初次免疫第0、15、18、21天，3組四肢累計評分差異均無統計學意義；從第24天開始，CIA組四肢累計評分明顯高于對照組；從第27天開始，治療組四肢累計評分高于對照組，低于CIA組（P＜0.05）；從第36天開始，CIA組和治療組組內四肢累計評分無明顯變化（P＞0.05），見圖7。

Fig.6 Comparison of TLR4,MMP?1 and MMP?3 protein expression in HFLS?RA圖6 HFLS?RA中TLR4、MMP?1和MMP?3蛋白表達情況比較

Fig.7 The clinical score of arthritis in each group圖7 各組小鼠四肢累計評分

2.6 HE染色觀察小鼠踝關節滑膜組織病理學變化對照組小鼠踝關節滑膜組織排列整齊，未見充血、水腫、炎性細胞浸潤等現象；CIA組小鼠踝關節滑膜組織有炎性細胞浸潤，關節炎、滑膜增生和軟骨組織病理學破壞；而治療組在第48天時踝關節病理變化較CIA組有所改善，其中炎性細胞明顯下降，軟骨破壞減輕，見圖8。

2.7 ELISA法檢測各組小鼠滑膜組織中TNF?α、IL?1β水平與對照組相比，CIA組小鼠滑膜組織中TNF?α、IL?1β水平明顯升高；與CIA組比較，治療組TNF?α、IL?1β水平降低（均P＜0.05），見圖9。

Fig.9 The TNF?αand IL?1βcontents in synovium of mice圖9 小鼠滑膜組織中TNF?α、IL?1β水平

3 討論

RA是一種病因不明的慢性全身性疾病，其基本病理改變為關節滑膜慢性炎癥形成侵襲性血管翳，破壞軟骨、骨及周圍組織［7］。由于IL?1β、TNF?α和IL?6等各類促炎細胞因子在RA滑膜炎癥中具有重要作用，因此抗炎被認為是RA的主要治療方法［8?9］。丹皮酚是從全草和毛茛科芍藥屬植物牡丹、芍藥根皮或蘿摩科植物徐長卿干燥根中提取分離出來的活性成分，其藥理學活性廣泛［10］。有研究表明，丹皮酚在各種組織和細胞中具有抗炎作用［11］，然而其對RA中促炎細胞因子的影響尚不明確。

在RA病理機制中，FLS活化增殖起著關鍵作用，其產生各種細胞因子和炎性趨化因子，如IL?6、IL?8和IL?15等，還能促進白細胞自血管內遷入滑膜、聚集于關節滑膜組織，使RA患者進入FLS過度增殖、遷移以及骨和軟骨破壞的惡性循環中，最終導致殘疾［12］。本研究MTT檢測結果顯示，10μg/L IL?1β作用48 h可顯著提高HFLS?RA細胞增殖能力，而丹皮酚在0.1～100μmol/L劑量下對IL?1β誘導的HFLS?RA細胞增殖無明顯抑制作用；ELISA檢測結果顯示，IL?1β誘導后HFLS?RA細胞中TNF?α和IL?6水平明顯升高，提示炎性環境下會促使HFLS?RA釋放炎性因子；而經不同濃度丹皮酚預處理后，HFLS?RA中TNF?α和IL?6水平降低，提示丹皮酚具有調節HFLS?RA介導的炎癥作用；HE染色結果示CIA小鼠踝關節有炎性細胞浸潤，關節炎、滑膜增生和軟骨組織病理學破壞，這與ELISA檢測結果基本一致。經丹皮酚治療后能減輕CIA小鼠滑膜炎癥和關節破壞，進一步提示丹皮酚具有治療RA滑膜炎癥的作用。

在調節促炎基因表達的轉錄因子中，NF?κB是一種能調節多種炎癥和免疫基因表達的誘導性轉錄調節因子［13］。TLR4是天然免疫系統識別主要受體，可引起NF?κB活化和炎性因子分泌，激活NF?κB，促使其核轉位，啟動下游炎性因子和細胞因子的轉錄和翻譯［14］。免疫熒光法觀察發現，與空白對照組相比，IL?1β誘導HFLS?RA中NF?κB?p65核移位，而丹皮酚抑制NF?κB p65的核移位，提示丹皮酚能靶向治療NF?κB介導的滑膜炎癥。此外，Western blot結果顯示，丹皮酚顯著抑制IL?1β誘導的HFLS?RA中TLR?4蛋白的表達，筆者推測丹皮酚可能通過下調TLR?4表達，抑制NF?κB信號通路激活，從而抑制促炎細胞因子釋放。這與ELISA檢測結果基本一致，丹皮酚可顯著降低小鼠滑膜組織中炎性因子TNF?α和IL?1β水平。

MMPs是一組鋅離子依賴性內肽酶，滑膜細胞來源的MMPs是導致關節病理損傷的重要因素之一［15］。MMPs可降解關節骨與軟骨中的膠原、蛋白多糖及其他的細胞外基質大分子，促進血管翳對軟骨的侵襲［16］。另有研究報道，活化的NF?κB轉位到核內與靶基因的κB基序結合，以調節包括細胞因子和炎性介質的表達，如可誘導細胞因子、趨化因子、黏附因子等的表達［17］。本研究Western blot結果顯示，與空白對照組相比，IL?1β誘導HFLS?RA中MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達水平升高，而1、10μmol/L丹皮酚處理后MMP?1、MMP?3和TLR4蛋白表達水平降低，提示丹皮酚可能減輕MMPs導致的關節病理損傷，這與HE觀察結果基本一致。筆者推測其機制可能與丹皮酚下調TLR4表達，抑制NF?κB p65核移位，從而減少MMPs表達有關。

綜上所述，丹皮酚具有抑制IL?1β誘導HFLS?RA炎性因子表達的作用，其機制可能與丹皮酚通過下調TLR4表達，抑制NF?κB信號通路激活，從而減少促炎細胞因子及MMPs釋放有關。同時，丹皮酚還可以降低CIA小鼠炎性細胞浸潤、滑膜增生和軟骨破壞，降低關節炎臨床評分，這些結果表明丹皮酚在治療RA方面具有潛在的應用前景。

Fig.3 Subcellular localization of NF-κB p65 observed by immunofluorescence assay(×400)圖3免疫熒光法觀察NF-κB p65亞細胞定位（×400）

Fig.8 Effects of paeonol on joint histology of CIA mice(HE Staining,×400)圖8丹皮酚對CIA小鼠關節組織學影響（HE染色，×400）