艾灸減輕新生小鼠缺氧缺血性腦病的作用及其機制研究

歐陽昕，徐優慧，陳明人，肖愛嬌△

新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）是指圍產期內各種因素引起的缺氧和（或）缺血導致的腦損傷［1］。該病發病率較高，在發達國家約為0.15%，在發展中國家為1%～2%［2］，同時具有高致殘率和死亡率的特點［3］。艾灸作為中醫療法的重要組成部分，在治療急性腦卒中方面具有明顯的優勢和特色，并取得了一定療效［4］。本課題組前期研究發現艾灸能明顯減輕成年大鼠腦缺血再灌注損傷［5?6］，為艾灸治療HIE提供了新思路。細胞凋亡參與了HIE的發病過程［7］，其中caspase?9、caspase?3分別是細胞凋亡啟動、執行的關鍵因子。本課題組前期也發現HIE小鼠腦組織凋亡細胞數明顯增加［8?10］。艾灸能否通過減少腦細胞凋亡進而減輕新生小鼠HIE尚不明確。本研究通過建立新生小鼠HIE模型，觀察艾灸對小鼠腦組織細胞凋亡、caspase?9和caspase?3表達的影響，以探討艾灸對新生小鼠HIE的抗細胞凋亡效應和機制。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級健康成年ICR小鼠12只，購自江西中醫藥大學實驗動物科技中心［SYXK（贛）2017?0004］。按雌鼠∶雄鼠=3∶1合籠，雌鼠孕期為21 d，待其自然分娩，小鼠出生當日計為P0，使用P7（出生后第7天）新生小鼠55只（不限雌雄）。主要試劑與儀器：凋亡原位檢測試劑盒（Millipore），兔抗小鼠caspase?9（Cell Signaling Technology），A11011山羊抗兔IgG（Invitrogen），caspase?3放射免疫檢測試劑盒（北京華英生物技術研究所），CM1950冰凍切片機和Leica2000熒光顯微鏡及圖像分析軟件（Leica），XH?6020全自動放免計數儀（西安核儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型制備將所有新生鼠按隨機數字表法分為假手術組（Sham組，17只）、模型組（HI組，21只）和艾灸組（MOX組，17只）。Sham組僅行頸部手術，不做缺血、缺氧處理。HI組閉合右側頸總動脈造成缺血，并置于缺氧箱進行缺氧處理。參照Rice等［11?12］的方法，結合本課題實際情況，8%O2處理100 min建立HIE模型。MOX組造模方法同HI組，并于缺氧后行艾灸治療。

1.2.2 治療方法MOX組施以艾灸療法：用長15 cm、直徑4 mm的艾條距大椎穴20 mm處懸灸，該穴定位參照文獻［13］。首次治療于造模后2 h進行，35 min/次，1次/d，連續治療3 d。

1.2.3 腦組織形態學觀察于術后3 d，各組分別取3只鼠給予4%異氟烷吸入麻醉后迅速取腦，拍照，隨后置于30%多聚甲醛蔗糖液中固定、脫水；待下沉后將腦取出，用PBS清洗后行冰凍切片，厚度35μm，最后將所有切片置于保護液中備用。使用時，隨機從每個樣本中抽取2片腦片，用含DAPI的封片劑封片后顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 TUNEL染色檢測腦組織細胞凋亡動物數量和取材方法同1.2.3。從保護液中抽取腦片，每個樣本取2片，PBS清洗后末端脫氧核糖轉移酶（TdT）工作液于37℃孵育1 h，加入終止液；PBS清洗后加入羅丹明標記物，室溫下放置30 min，PBS清洗，含DAPI的封片劑封片。TUNEL染色后使用熒光顯微鏡觀察并拍照。Image J軟件計數400倍視野下的陽性凋亡細胞數。

1.2.5 腦組織caspase?9陽性細胞檢測動物數量和取材方法同1.2.3。從保護液中抽取腦片，每個樣本取2片，PBS漂洗后山羊血清封閉，加入兔抗小鼠caspase 9一抗（1∶500，陰性對照不加一抗，用PBS代替）于4℃孵育過夜；次日PBS清洗，加入山羊抗兔二抗（1∶500）于室溫下避光孵育1 h，PBS清洗，含DAPI的封片劑封片。免疫熒光染色后熒光顯微鏡觀察、拍照。Image J軟件計數整個200倍視野下的caspase?9陽性細胞數。

1.2.6 腦組織caspase?3含量檢測于術后3 d，各組分別取8只鼠進行腦組織caspase?3含量檢測。給予小鼠異氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取腦，分離患側大腦半球，勻漿后采用放射免疫分析法測定腦組織總蛋白和caspase?3含量。

1.3 統計學方法統計分析用Graphprism 5.01軟件，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠腦組織形態學改變

2.1.1 大體觀察Sham組腦組織紅潤，腦溝及腦回清晰，未出現梗死灶；HI組右半球見大面積梗死灶，腦組織液化、壞死，腦溝、腦回消失；MOX組右半球可見小面積梗死灶，腦溝變淺、腦回變寬，見圖1。

Fig.1 Gross brain morphological structure in three groups圖1 小鼠腦大體形態

2.1.2 鏡下觀察Sham組右側腦組織排列致密，腦細胞無明顯脫落；HI組患側腦組織排列疏松，腦細胞脫落甚多；MOX組患側腦組織排列較致密，腦細胞脫落較少，見圖2。

2.2 3組小鼠腦組織細胞凋亡情況TUNEL陽性細胞呈紅色，與Sham組相比，HI組腦組織凋亡細胞數明顯增多；與HI組相比，MOX組腦組織凋亡細胞數明顯減少，見圖3、4。

Fig.4 Comparison of the TUNEL?positive cells in brain tissues between three groups圖4 各組小鼠腦組織TUNEL陽性細胞數比較

2.3 3組小鼠腦組織caspase?9表達情況caspase?9陽性細胞呈綠色，與Sham組相比，HI組腦組織caspase?9陽性細胞數明顯增多；與HI組相比，MOX組腦組織caspase?9陽性細胞數明顯減少（P＜0.01），見圖5、6。

Fig.6 Comparison of the expression of caspase?9 in brain tissues between three groups圖6 各組小鼠腦組織caspase?9表達水平比較

2.4 3組小鼠腦組織caspase?3含量比較HI組和Sham組腦組織caspase?3含量差異無統計學意義；MOX組caspase?3含量明顯低于HI組，見圖7。

3 討論

針對新生兒HIE的治療，現代醫學主要采用低溫療法［14］、高壓氧療法［15］等，但都存在一定的局限性。低溫療法是目前唯一被循證醫學證實有效治療HIE的方法，具有降低病死率和致殘率、改善神經癥狀等優勢［16］，許多發達國家的新生兒重癥監護病房（NICU）已將其作為治療新生兒HIE的常規方法。但是針對足月小樣兒以及早產兒，低溫療法的效果并不明顯［17］，且接受低溫治療的患兒中仍有40%～50%死亡或伴有嚴重的神經系統發育異常［18］，受益的患者僅占1/6［19］。而高壓氧療法在治療新生兒HIE則會出現晶體后纖維增生等不良反應［20］。

Fig.7 Comparison of the content of caspase?3 of brain tissues between three groups圖7 各組小鼠腦組織caspase?3含量比較

為了克服現代醫學治療新生兒HIE的局限，本課題組在中醫療法方面進行了探索。祖國傳統醫學素有病變在腦，首取督脈之說。大椎穴為督脈上的要穴，且具有調節手足陽經氣血和補益腦髓等作用。因此，筆者選取大椎穴對HIE新生小鼠進行艾灸治療，發現艾灸大椎穴可以縮小新生小鼠HIE后的腦梗死灶、減輕缺氧缺血性腦損傷。然而，艾灸減輕缺氧缺血性腦損傷的作用機制尚不明確。

新生兒HIE的發病機制涉及細胞凋亡、氧化應激等方面［21］。其中，細胞凋亡在新生兒HIE的發病過程中起重要作用［7］，尤其在未成熟腦中作用更明顯［22］。本課題組前期研究發現HIE小鼠腦組織凋亡細胞數明顯增加［8?9］。本研究也得到了類似的結果，通過艾灸治療后腦組織凋亡細胞數較HI組明顯減少，提示艾灸可能通過減少細胞凋亡達到減輕缺氧缺血性腦損傷的目的。

細胞凋亡由復雜的胞內級聯反應組成，Bcl?2家族、caspase家族等都與細胞凋亡相關聯。其中，caspase家族自始至終貫穿細胞凋亡的整個過程，其既是啟動者，又是調控者，更是執行者［23］。細胞凋亡主要有內源性途徑（又稱線粒體依賴性凋亡通路）和外源性途徑（也稱死亡受體介導的凋亡通路）兩種［24］。其中線粒體介導的調亡在哺乳動物細胞的多種生物學過程中起關鍵作用［25］。當細胞受刺激后，細胞色素C（Cyt C）從線粒體膜間隙釋放到細胞質中，然后與細胞凋亡激活因子1（Apaf?1）結合，接著活 化caspase?9前 體。活 化 后 的caspase?9激 活caspase?3，后者執行凋亡過程，最終導致細胞凋亡［26］。本研究結果顯示，與HI組相比，MOX組小鼠腦組織中caspase?9和caspase?3表達水平明顯下降，提示艾灸可能通過降低腦組織caspase?9和caspase?3表達水平，從而減少細胞凋亡。

綜上所述，艾灸可能通過降低caspase?9和caspase?3表達水平、減少細胞凋亡而達到減輕新生小鼠HIE。目前針對艾灸治療新生兒HIE機制的研究較少，本研究為深入探究艾灸治療新生兒HIE的作用機制提供了可借鑒的依據。

Fig.2 Results of DAPI staining of brain sections in three groups(×400)圖2各組小鼠腦組織切片DAPI染色結果（×400）

Fig.3 Results of TUNEL staining of brain tissues in three groups(×400)圖3各組小鼠腦組織TUNEL染色結果（×400）

Fig.5 Results of caspase-9 expression detected in brain tissues in three groups(immunofluorescent staining,×200)圖5各組小鼠腦組織caspase-9表達結果（免疫熒光染色，×200）