PD?L1過表達在DENV?2誘導血管內皮細胞自噬和凋亡中的作用機制

姚峰，朱磊，程波，楊明，劉敏

登革病毒（dengue virus，DENV）是引起登革熱、登革出血熱和登革綜合征的病原體，為單正鏈RNA，屬于黃病毒科，主要通過蚊蟲（埃及伊蚊或白紋伊蚊）叮咬傳播，流行于熱帶及亞熱帶地區［1］。DENV分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ血清型，其中以Ⅱ型登革病毒（dengue virusⅡ，DENV?2）傳播最為廣泛［2］。血管內皮細胞是DENV引起病變的主要部位之一，DENV可對血管內皮細胞造成損傷［3?4］。研究顯示，DENV?2能誘導EAhy926細胞發生自噬［5］，通過線粒體途徑誘導EAhy926細胞凋亡［6］。但具體的信號機制尚不明確。程序性細胞死亡受體?1配體（programmed death?1 ligand，PD?L1）是腫瘤免疫治療的靶點之一，且參與細胞自噬活動［7?8］。但PD?L1是否與DENV?2誘導的人血管內皮細胞自噬和凋亡有關尚無定論。本文以EAhy926細胞為研究對象，觀察PD?L1過表達在DENV?2影響血管內皮細胞自噬和凋亡中的作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料EAhy926細胞購自上海研酶生物科技有限公司；DENV?2病毒株購自北京義翹神州科技有限公司。DMEM/F12培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司；胎牛血清（FBS）、青?鏈霉素購自美國Gibco公司；自噬蛋白微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule?associated protein1 light chain3B，LC3B）抗體、B淋巴細胞瘤?2（B?cell lymphoma?2，Bcl?2）抗體、自噬相關蛋白Beclin?1抗體、PD?L1抗體和α微管蛋白（α?Tubulim）抗體購自美國CST公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG（IgG?HRP）二抗和羊抗小鼠IgG?HRP二抗購自美國圣克魯斯公司；甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自武漢Bioworld公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PD?L1慢病毒載體過表達試劑盒購自上海吉瑪公司。SpectraMax M5e多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司），Leica DMi8倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），Accuri C6 Plus流式細胞儀（美國BD公司），E?Gel Imager凝膠成像系統（美國Invitrogen公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養EAhy926細胞用DMEM/F12培養液（含10%FBS和1%青霉素?鏈霉素）置于37℃、5%CO2的培養箱中培養至對數生長期用于后續實驗。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞增殖活力收集對數生長期EAhy926細胞，以每孔100μL細胞懸液（0.9×107個/L）接種于96孔板中，過夜培養，次日吸出培養基加入含梯度濃度DENV?2（1×108、2.5×108、5×108、1×109、2×109pfu/L）的無血清DMEM/F12培養基；同時設置對照組和調零孔，對照組在細胞中加入無血清DMEM/F12培養基，調零孔在空白孔加入無血清DMEM/F12培養基。細胞處理24 h和48 h時每孔加入20μL MTT，放入培養箱繼續培養4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min。酶聯免疫檢測儀于490 nm處測量各孔的吸光度（A）值，計算DENV?2處理組細胞增殖活力（%）=［（ADENV?2?A調零）/（A對照?A調零）］×100%，半數抑制濃度（50%concentration of inhibition，IC50）由Graphpad Prism7.0求得。實驗共重復3次。

1.2.3 慢病毒轉染法過表達PD?L1蛋白將EAhy926細胞接種至12孔板，細胞生長至50%融合度時轉染。加入10 mg/L聚凝胺（polybrene）和10%FBS的DMEM培養基。載有PD?L1的慢病毒液和空載慢病毒液分別稀釋50倍，各吸取50μL至細胞中，分別設為轉染組和空載對照組。所有慢病毒液均載有綠色熒光標簽。同時，以未轉染的正常EAhy926細胞作為空白組。各組細胞置于培養箱培養18 h后更換為含10%FBS的DMEM/F12培養基，當細胞生長至90%融合度時以嘌呤霉素進行篩選。熒光顯微鏡下觀察空白組、空載對照組和轉染組慢病毒進入細胞情況；蛋白印跡法檢測各組PD?L1蛋白表達情況。

1.2.4 蛋白印跡法檢測蛋白表達據MTT結果，DENV?2對EAhy926細胞48 h的半數抑制濃度（IC50）為1.2×109pfu/L，為后續實驗濃度。DENV?2（1.2×109pfu/L）處理EAhy926細胞12 h、24 h、48 h作為DENV?2 12 h組、DENV?2 24 h組及DENV?2 48 h組，同時設置對照組；另一實驗以DENV?2（1.2×109pfu/L）處理空載對照組和轉染組48 h。收集各組細胞并提取總蛋白，以BCA試劑盒進行蛋白定量。各組以30 μg上樣量進行10%SDS?PAGE，濕轉PVDF膜，常溫下以5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，TBST緩沖液洗膜3次，以LC3B抗體（1∶1 000）、Bcl?2抗體（1∶2 000）、Beclin?1抗體（1∶2 000）、Tubulin抗體（1∶2 000）或PD?L1抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，再加入羊抗小鼠或羊抗兔IgG?HRP二抗（1∶2 000）室溫雜交1 h，PVDF膜洗滌3次后以ECL化學發光試劑盒進行顯色，凝膠成像儀進行成像。以Tubulin作為內參蛋白，用Image J（v1.8.0）對所有蛋白灰度值進行處理和分析，處理組目的蛋白相對表達量=（處理組目的蛋白灰度值/Tubulin灰度值）/（對照組目的蛋白灰度值/Tubulin灰度值）。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率分組同1.2.4。處理結束后將細胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，參考文獻［9］和說明書進行Annexin V?PI染色，檢測細胞凋亡情況。細胞總凋亡率（%）=第一象限百分率+第四象限百分率。

1.3 統計學方法采用Graphpad Prism 7.0軟件對數據進行統計處理。符合正態分布的計量數據以x±s表示，2組間均數比較用t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DENV?2抑制EAhy926細胞增殖與對照組比較，1×108、2.5×108、5×108、1×109、2×109pfu/L DENV?2處理24 h和48 h均可劑量依賴性抑制EAhy926細胞增殖（P＜0.01），見圖1。DENV?2 24 h和48 h的IC50分別是1.8×109pfu/L和1.2×109pfu/L。

Fig.1 The effect of DENV?2 on the proliferation of EAhy926 cells圖1 DENV?2對EAhy926細胞增殖能力的影響

2.2 DENV?2對EAhy926細 胞LC3B、Beclin?1及Bcl?2蛋白表達的影響與對照組比較，DENV?2（1.2×109pfu/L）處理12、24、48 h均可上調EAhy926細胞LC3Ⅱ/LC3I和Beclin?1蛋白表達，下調Bcl?2蛋白表達，呈時間依賴性（P＜0.05），見圖2、表1。

Fig.2 The effect of DENV?2 on the autophagy in EAhy926 cells圖2 DENV?2對EAhy926細胞自噬能力的影響

Tab.1 The expression levels of autophagy-related proteins in four groups of EAhy926 cells表1 各組EAhy926細胞自噬相關蛋白表達水平（n=3，x±s）

2.3 DENV?2對EAhy926細胞凋亡率的影響對照組、DENV?2 12 h組、DENV?2 24 h組及DENV?2 48 h組的EAhy926細胞凋亡率分別為（6.33±0.86）%、（12.05±1.50）%、（19.85±2.26）%、（27.30±0.03）%，呈依次增高趨勢（n=3，F=160.000，P＜0.05），見圖3。

2.4 PD?L1蛋白過表達驗證與空白組比較，空載對照組和轉染組細胞有較強的綠色熒光。空白組、空載對照組和轉染組PD?L1蛋白相對表達水平分別為0.21±0.02、0.19±0.02和1.06±0.09，差異有統計學意義（n=3，F=249.400，P＜0.01），其中與空載對照組比較，轉染組PD?L1蛋白表達明顯上調（P＜0.05），空白組和空載對照組細胞差異無統計學意義，見圖4。

2.5 過表達PD?L1對DENV?2誘導的細胞凋亡和自噬的影響DENV?2處理48 h后，與空載對照組比較，轉染組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin?1蛋白相對表達水平下降，Bcl?2蛋白相對表達水平上升，細胞總凋亡率下降（P＜0.01），見圖5、表2。

3 討論

DENV可引起登革出血或登革綜合征，可對血管內皮細胞造成損傷，而血管內皮細胞是DENV引起病變的主要部位之一［3?4］。因此，探討DENV對血管內皮細胞的影響及相關機制具有重要意義。EAhy926細胞為重組血管內皮永生細胞，具有明顯的血管內皮細胞特性，被廣泛用于血管內皮細胞的相關基礎研究。本研究以DENV?2（1×108～2×109pfu/L）處理EAhy926細胞，發現細胞增殖被抑制并呈劑量依賴性，提示DENV?2可能通過某種信號機制誘導細胞損傷，進而引起增殖抑制或細胞凋亡。

Fig.3 The effect of DENV?2 on the apoptosis of EAhy926 cells圖3 DENV?2對EAhy926細胞凋亡的影響

Fig.4 Successful construction of PD?L1 overexpressing in EAhy926 cells圖4 成功構建PD?L1過表達EAhy926細胞

Fig.5 The effect of overexpression of PD?L1 on DENV?2 induced apoptosis and autophagy圖5 過表達PD?L1對DENV?2誘導的細胞凋亡和自噬的影響

Tab.2 Comparison of the expression levels of autophagy-related proteins and the total apoptosis rate between 2 groups of cells表2 2組細胞自噬相關蛋白表達水平及總凋亡率比較（n=3，x±s）

研究發現，細胞死亡前胞漿中存在大量的自噬體或自噬溶酶體，但自噬細胞缺乏核固縮、核破裂、細胞皺縮、凋亡小體的形成等凋亡的典型特點，因此自噬又稱為“Ⅱ型”或“自噬”非凋亡程序性細胞死亡［10?11］。自噬與凋亡程序均可調控細胞死亡［12］。研究認為，自噬與凋亡通路具有一些共用的信號蛋白，因此自噬和凋亡可產生相互影響［13］。激活自噬可以保護心臟免受心肌缺血和缺血后心臟重塑的影響，從而減輕心肌細胞凋亡［14］。另有研究顯示，自噬可通過mTOR信號通路抑制高糖誘導的心臟微血管內皮細胞凋亡［15］。因此，自噬參與心血管內皮細胞的凋亡過程。最近的研究顯示，DENV?2可誘導細胞間黏附分子?1表達上調和自噬，最終誘導人肝竇內皮細胞凋亡［16］。DENV?2能誘導人血管內皮細胞EAhy926發生自噬［5］，并通過線粒體途徑誘導人血管內皮細胞EAhy926凋亡［6］。

LC3Ⅱ與LC3Ⅰ是LC3B的2種水解形態，當細胞發生自噬時LC3Ⅱ與LC3Ⅰ蛋白表達比值升高［17］。Beclin?1是自噬關鍵調控蛋白之一，參與自噬 體 膜 形 成；Bcl?2可 與Beclin?1結 合 并 抑 制Beclin?1的活性，Bcl?2也是經典的凋亡抑制蛋白，其表達下調與細胞凋亡增加有關［18］。本研究增殖實驗顯示，48 h時DENV?2對EAhy926細胞的IC50為1.2×109pfu/L，由于此時細胞存活和死亡細胞均占50%，有利于觀察自噬和凋亡相關指標，因此選取此濃度進行后續實驗。本研究結果顯示，與對照組比較，DENV?2處理12 h、24 h、48 h均可上調EAhy926細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin?1蛋白表達，下調Bcl?2蛋白表達；流式細胞術結果顯示，對照組、DENV?2 12 h組、DENV?2 24 h組 及DENV?2 48 h組 的EAhy926細胞凋亡率呈依次增加趨勢，表明DENV?2可能通過調控Bcl?2/Beclin?1通路上調LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，進而誘導EAhy926細胞自噬和凋亡，而Bcl?2作為關鍵蛋白，其表達下調同時導致自噬和凋亡的增強，可能是DENV?2誘導血管內皮細胞損傷的潛在治療靶點。

PD?L1為PD?1的配體，兩者結合所組成的免疫檢查點可抑制T細胞的活化及細胞因子的產生［7］。在血管內皮細胞、胰島細胞以及免疫豁免部位（如胎盤、睪丸和眼睛）等非造血細胞PD?L1表達水平較低［19］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTORC1）是細胞自噬中的重要調控靶點，其激活能抑制細胞自噬［20］。在腫瘤免疫調控實驗中發現，腫瘤細胞固有的PD?L1可促進MTORC1信號激活，從而促進腫瘤細胞生長，使腫瘤細胞自噬活動處于“靜息狀態”［21］。為觀察PD?L1在DENV?2誘導EAhy926細胞自噬和凋亡中的作用，本研究以慢病毒為載體外源性上調EAhy926細胞PD?L1蛋白表達，并以嘌呤霉素篩選了穩定表達的細胞，結果發現，PD?L1過表達后DENV?2對EAhy926細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin?1及Bcl?2蛋白表達的誘導被逆轉，且細胞凋亡明顯減少，表明過表達PD?L1能抑制DENV?2誘導的EAhy926細胞自噬和凋亡，而該作用可能與抑制Bcl?2/Beclin?1信號通路有關。

綜上所述，DENV?2可能通過Bcl?2/Beclin?1通路上調LC3Ⅱ/LC3I，進而誘導EAhy926細胞自噬和凋亡。PD?L1過表達可逆轉DENV?2的上述誘導效應，這可能是DENV?2誘導血管內皮細胞損傷的保護靶點。PD?L1與自噬的相關性研究豐富了PD?L1蛋白的生物學功能，但PD?L1的下游信號靶點還未完全清楚，有待于更多實驗驗證。