定量體外診斷試劑參考區間建立與臨床評價關系探究

【作 者】蔡瑤，付文竹，付央，郭麗，徐加發

1 江蘇省藥品監督管理局審評中心，南京市，210002

2 廣東省藥品監督管理局審評認證中心，廣州市，510080

3 江蘇碩世生物科技股份有限公司，泰州市，225300

0 引言

參考區間研究和臨床評價（此臨床評價概念包含臨床試驗，下同）是第二和第三類體外診斷試劑性能研究的重要內容，經確定的參考區間對于臨床評價具有重要指導意義，臨床評價過程反過來也會檢驗參考區間的合理性。雖然研究重點和方法不同，但兩者相互聯系，相互支撐。目前企業在產品研發、臨床評價及注冊過程中，往往忽略參考區間確定和臨床評價之間的協同作用，導致資料前后無法相互印證，甚至有時相互矛盾。

1 參考區間的建立

定量體外診斷試劑的參考區間是參考下限和上限之間的值。某些情況只有其中一個參考限有意義，常為參考上限（x），則其參考區間為0～x[1]。

CLSI C28-A3指南中指出：參考區間建立首先需根據明確的標準選擇參考個體，所有參考個體組成參考人群，然后對參考人群進行抽樣，得到可代表參考人群的參考樣本組，通過觀察或測量參考樣本組中的參考個體而得到參考值，這些參考值的分布情況形成參考分布[1]。根據被測物的臨床意義和產品預期用途，確定參考分布的某一個或幾個值為參考限，常見情形是以參考分布的單側（95%）或雙側（2.5%和97.5%）百分位數為參考限，比如某些被測物濃度過高和過低均提示身體異常，一般以參考分布的2.5%和97.5%百分位數為參考下限和上限；若參考區間分組，則各組也有各自的參考限形成的亞組參考區間。

從參考區間的獲得過程可以看出，參考人群和參考樣本組是統計學上的總體和抽樣樣本組的關系。參考人群是一個符合規定標準的總體，參考樣本組是從參考人群抽樣得到的能代表參考人群的抽樣樣本組，而參考區間來自抽樣樣本組，因此設置參考人群的標準不同，參考區間也必然會有差異[2]。參考區間可用于區分個體的健康狀況，也可提示人體處于不同生理或病理過程[3]。選擇參考個體時應根據產品預期用途設置相應的參考人群標準，這對于臨床評價中目標人群的選定具有指導意義。

需注意，不同被測物因預期用途不同而參考個體的選擇標準通常不同。某被測物排除的個體可能是其他被測物納入的參考個體，即使相同的被測物如具有不同的預期用途，其參考個體的選擇標準也不同。比如常規C反應蛋白為非特異性炎癥輔助診斷指標，其參考個體的選擇標準一般為非炎癥患者；而超敏C反應蛋白在臨床上主要用于評價心血管疾病風險，其參考個體的選擇標準一般為非心血管疾病患者。目前很多項目在進行參考區間研究時，往往傾向于選擇年輕健康的個體作為參考個體。若被測物受年齡影響，則易導致從年輕健康人群中獲得的參考區間與目標人群的實際參考區間差異較大，這種差異會在臨床評價中引入較大的偏倚。

獲得產品參考區間的常用方法之一是建立參考區間。如已有國家或國際公認參考區間，則可直接獲得參考區間，此時需重點關注檢測結果的準確性。通常在確定新被測物、不同的人群或新分析方法（比如新方法有更優的靈敏度和特異性）的參考值時，需要建立參考區間。此外如已建立的參考區間不適用或與新產品差異較大，也應建立相應的參考區間。

確定參考上限/下限的兩種統計方法為參數法和非參數法，前者要求檢測值或經轉化后符合正態分布，后者無此要求。目前有些項目在建立參考區間的過程中缺乏對數據進行正態分布的統計學檢驗，而直接采用參數法計算參考區間，容易導致得到的參考區間與實際情況差異較大。多數情況為從參考樣本組獲得的數據并不符合或無法轉換成正態分布，因此非參數法是建立參考區間更為推薦的方法。但不管采用哪種方法，統計學上要求至少120例樣本才能達到參考區間的90%置信限。

參考區間是否分組需要考慮不同組的參考值差異，對臨床判斷的影響，以及產品預期用途對分組的要求等。當目標人群分層時需要對參考區間進行分組，每組應不少于120例樣本。比如檢測血清和尿液樣本的β2微球蛋白，不同樣本類型的參考值有顯著差異，需要制定各自的參考區間；又如孕酮因不同性別、年齡段、生理周期中的水平差異較大，如果產品預期用途涵蓋了對不同人群的輔助診斷，建議提供各人群的參考區間。

2 參考區間的驗證

建立可靠的參考區間是一項巨大且耗時耗力的工作，因此參考區間驗證也是確定參考區間的常用方法。此方法采用相對較少的參考個體，將已建立的參考區間轉移到另一項研究中，使得該參考區間在新的情況下使用。基于最原始參考值研究的合理性假設，參考區間轉移需要重點考慮分析系統和參考人群的可比性。分析系統的可比性主要包括樣本采集和處理（如樣本類型、采集部位、采集和儲存時間、抗凝劑）、分析方法和使用儀器（如采用的校準品及校準方法、儀器的性能參數）等；參考人群的可比性主要包括性別和年齡、地域分布、用藥狀態、飲食習慣等。如果不同方法間具有可比性，那么參考人群間的差異是參考區間驗證的主要影響因素。參考區間驗證采用參考個體進行評估和驗證，這些參考個體來自接收該參考區間的參考人群，將檢測結果與原始參考值進行對比。如果兩個分析系統之間差異較大，或者目標人群差異大，則不適用通過這種方法獲得參考區間。

參考區間驗證的核心問題是參考個體/人群的一致性。驗證應建立在參考個體/人群擁有較為一致的背景信息的基礎上，這對臨床試驗設計中目標人群的確定具有十分重要的意義。而目標人群最終體現在產品的預期用途上，這是所有體外診斷試劑在產品設計開發及臨床運用中要重點考慮的因素。參考區間驗證也是臨床機構常用方法，具體可參考相關文件[4]。

3 臨床評價

《體外診斷試劑注冊管理辦法》規定：申請人或者備案人可以通過臨床文獻資料、臨床經驗數據、臨床試驗等信息對產品是否滿足使用要求或者預期用途進行確認[5]。臨床評價是對產品臨床性能進行的系統性研究，是對產品預期用途進行確認必不可少的工作。具體的操作方法可根據國家藥監局發布的文件要求進行[6-7]。

根據選擇的比較對象不同，臨床評價可分為與診斷“金標準”的比較研究及與已上市產品的比較研究。有的“金標準”為單一確定標準，如組織病理學檢查、影像學檢查、病原體分離培養鑒定等，主要是基于客觀的證據；有的為采用多種方法或方式綜合判斷，如長期隨訪，結合患者病史、臨床癥狀、多種檢測結果等，這實質上是綜合多種客觀資料盡量降低主觀判斷帶來的誤差。

對于與已上市產品比較的臨床評價中對照試劑的選擇問題，選擇對照試劑的一個重要原則是選擇最合適的而非最優的。既要考慮已上市產品種類多，質量參差不齊的情況，也要充分考慮對照試劑在諸如方法學、預期用途、性能指標、校準品溯源、參考區間等方面的差異。因為臨床評價目的是證明考核試劑和對照試劑等效，如果雙方的性能相差較大或預期用途不同，那么證明兩者等效的出發點可能就是錯誤的。另外如果在臨床前研究時發現對照試劑的質量與考核試劑差異明顯，這種情況更推薦采用與方法學更具有優勢的產品或者與“金標準”進行對比。

4 參考區間與臨床評價的關系

在臨床實踐中參考區間往往是臨床醫生對檢測值做出正常/異常判斷的標準之一，為臨床診斷提供參考。參考區間研究和臨床評價必須緊扣產品預期用途。參考區間研究來自參考人群，代表了多數參考個體的被測物的濃度范圍。當對某受試者進行檢測，檢測值落在參考區間外，提示該受試者的身體可能存在異常。參考區間研究中所確定的參考人群即為產品預期用途中所描述的目標人群。臨床評價是對產品預期用途進行確認的過程，也可以理解為在真實的臨床環境中對目標人群進行檢測，并結合參考區間從而確定產品能準確識別或提供信息幫助區分正常和異常人群。

前文提到的與已上市產品對比的臨床評價，雖然這類研究是證明申報產品與對照產品等效，但是申報產品依據其參考區間做出的臨床判斷與樣本臨床背景的符合性也應重點關注，這種符合性在與“金標準”對比的臨床評價中往往是評價產品是否能實現預期用途的標準之一。

以與“金標準”對比的臨床評價為例，納入的受試者包含已經明確了的正常人群和異常人群，根據參考區間對納入的受試者的檢測值進行正常或異常的判斷，之后評估該判斷與受試者的臨床背景信息或臨床診斷是否有較好的符合性。因此，研究得到的參考區間一定要適用相應的臨床評價，即符合產品預期用途，防止在臨床評價過程出現基于參考區間的評價結果與受試者的臨床背景的一致性較低的情況（如從A人群中獲得參考區間用于判斷B人群，導致過多的正常受試者被判定為異常）。

5 對參考區間研究和臨床評價的建議

（1）溯源性。影響參考區間的因素除了參考人群外，產品的定值溯源也是重要因素。不同溯源產品的檢測結果是否具有可比性是值得商榷的，如果同類產品來自不同的定值溯源，那么相同檢測數值代表的量可能是不同的。在實際檢測過程中表現為對同一樣本進行檢測，不同產品的檢測結果相差較大。這種情況下即使是相同參考人群，各自得到的參考區間也可能相差較大。因此在臨床評價選擇對照產品的過程中須考慮校準品的溯源情況。現實中可能存在無法獲得對照產品溯源信息的情況，建議盡量選擇性能指標等接近的對照產品，同時通過預實驗的檢測量值來做進一步的評估。

（2）預期用途。在開展參考區間研究和臨床評價之前，首先應明確產品預期用途。產品預期用途決定了這兩項研究應該如何開展。產品預期用途包括目標人群（如成年人、兒童；性別；疾病史；藥物治療史等）、使用環境（如家用、臨床機構使用）、樣本類型及要求（如尿液、血清；空腹采集；抗凝劑）、檢測結果的預期使用（如診斷疾病、指導用藥、提示損傷、預后監測）等。

產品預期用途決定了參考區間研究的參考人群，進而決定了參考區間適用的目標人群。預期用途也決定了臨床評價中納入的受試者，反過來也可以理解為臨床評價在哪類受試者中進行了確認，那么即代表產品將來適用于相應的目標人群。例如用于檢測成年人群空腹全血的產品，其參考區間和臨床評價均應采用成年人空腹全血樣本。又如補體C3檢測試劑臨床評價納入的受試者均為癌癥患者，而該產品的預期用途為主要用于補體低下或免疫缺陷性疾病的輔助診斷，這樣的受試者顯然缺乏代表性，臨床評價考察的人群與產品的預期用途不符。再如用于輔助診斷新型冠狀病毒肺炎患者的核酸檢測試劑，在臨床實驗設計時，針對的目標人群主要是《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中明確的疑病例類型，比如有密切接觸史，發熱和/或呼吸道癥狀；具有上述肺炎影像學特征；發病早期白細胞總數正常或降低，淋巴細胞計數減少等，但據了解，目前有很多無相應癥狀的受試者亦被納入臨床試驗中作為目標人群，這顯然是不合適的[8]。

（3）分組設計。參考區間的分組與臨床評價之間有著密切聯系。參考區間分組主要考慮以下幾點：第一，各個參考值之間的差異較大，是否影響預期用途的實現。造成參考值的差異的來源有多種，比如年齡、性別、樣本類型（比如用于多種樣本類型檢測的產品）、樣本取樣時間（比如檢測血糖的產品）、生理周期和妊娠周期（比如檢測性激素的產品）等。在目前很多的產品中，不同樣本類型中同一目標物的濃度差異很大，這種情況下，很有必要分別進行參考區間的研究，同時在臨床評價中也應有相應的樣本驗證。第二，根據預期用途的不同來確定是否需要分組。比如用于檢測空腹和餐后2 h血糖的產品，參考區間分組為空腹血糖的參考區間和餐后2 h的參考區間，臨床評價也相應在這兩種受試者中進行評估。第三，臨床上會遇到一些比較特殊的群體（例如孕婦或嬰幼兒），其檢測值通常與正常人不同，如臨床上用到的PCT，新生兒出生時的PCT含量往往很高[9]，如果僅根據常人的參考區間很容易誤診。再如C反應蛋白，在懷疑嬰幼兒有炎癥感染時，臨床上常用指尖全血檢測C反應蛋白，結合白細胞計數等血常規指標來輔助診斷是細菌感染還是病毒感染以及感染的嚴重程度。而指尖全血屬于末梢血，應考慮獨立的參考區間。

參考區間與臨床評價作為體外診斷試劑上市前研究的兩個重要研究內容，兩者相互印證、相輔相成。在產品預期用途的確定、參考人群的選擇、統計學方法的運用等方面均存在著密切聯系。無論是參考區間研究還是臨床評價研究，最終的落腳點都是臨床實際中的產品預期用途。根據設定的預期用途，結合參考區間確定過程中需要考慮的因素及方法，在臨床評價中遵循臨床試驗設計的同時，也應嚴格按照設定的參考標準來對數據結果進行分析統計。只有這樣才能真正科學、客觀地評價產品的分析性能和臨床性能，真正能夠用于指導臨床診斷、治療等過程，實現產品的臨床價值。