絲素蛋白的制備方法及在生物醫用材料領域的應用

【作 者】王苗苗，韓倩倩

1 煙臺大學，煙臺市，264005

2 中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

0 引言

蠶絲是一種主要由內層的絲素蛋白和外層的絲膠蛋白組成的天然絲，是熟蠶結繭時所分泌絲液凝固而成的連續長纖維，也是一種天然纖維。絲素蛋白作為一種不溶于水的天然大分子材料，約占蠶絲總質量的75%。作為蠶絲的主體組成部分，絲素蛋白不僅含有人體必需氨基酸，對機體沒有毒性、致敏性、刺激作用，而且大部分可被生物體所降解[1]。在生物醫用領域，它不但與人體具有良好的親和性，而且最重要的是，絲素蛋白在可控條件下可以實現水溶性與非水溶性的雙向轉化的特點，使得其可根據所需進行后期加工。絲素蛋白來源廣泛，制備方法簡單，根據不同的應用場合，再生和加工成薄膜、海綿、水凝膠、微球等不同的形態[2]。隨著加工技術的不斷改進與完善，絲素蛋白將具有更加廣闊的應用前景。

1 再生絲素蛋白溶液的制備

1.1 蠶絲的脫膠工藝

有文章表明，當絲膠蛋白單獨使用時，不會誘導免疫反應，而當絲素蛋白和絲膠蛋白混合使用時，會引起蠶絲蛋白的免疫原性[3]。因此，蠶絲的脫膠是絲素蛋白在生物醫用材料領域應用的關鍵部分。由于絲素也是一種蛋白質，在對蠶絲進行脫膠過程中，往往會導致絲素的力學強度和絲素蛋白分子量的下降。因此，在蠶絲脫膠工藝中，如何選擇合適的脫膠劑以及脫膠條件尤為重要。脫膠的好壞，對絲的質量和原料的制成率都有極大的影響[4]。譬如，絲素蛋白在生物醫用材料方面的應用中，未脫膠或者脫膠不徹底，可能會引起人體的一些炎癥反應，往往以巨噬細胞的增多為主要表現[5]。但是如果脫膠過度，則會影響絲素的蛋白質結構。因此，選擇合適的脫膠方法對脫膠效果的好壞至關重要。

蠶絲的脫膠原理是基于：絲膠是一種具有水溶性特點的蛋白，而絲素不溶于水，在一定外界條件下，絲膠進行溶解并從絲素上脫除下來，從而達到脫膠的目的[6]。脫膠工藝經過多年的不斷發展，堿法脫膠是目前使用最多的脫膠工藝之一，和其它脫膠工藝相比，具有效果明顯、成本低、時間短等優勢，不同的堿性試劑對蠶絲脫膠的效果以及脫膠后絲素蛋白分子量和絲素纖維的力學性能、表面形貌的影響差異均比較大[7]，常選用的堿性試劑有碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、尿素等；除此之外，酸法脫膠、酶法脫膠及高溫高壓法等工藝也被廣泛應用。檸檬酸、酒石酸等有機酸常作為酸性脫膠劑被使用，但這種方法不但成本比較高，而且操作過程中也不易控制[8]；酶法脫膠雖是一種簡單易操作的蠶絲脫膠方法，但使用成本較高，不適用于大規模使用；高溫高壓法是一種高效率、低污染、低成本、無需多次脫膠的工藝，但該方法在操作過程中往往會破壞絲素的水解，導致絲素纖維的力學強度和絲素蛋白的分子量明顯降低。

1.2 蠶絲的溶解工藝

絲素蛋白難以溶解，只有用強酸、強堿或高濃度鹽才能溶解。由于強酸和強堿溶解絲素蛋白會破壞其分子鏈，使絲素分子量大大降低。因此，選擇合適的溶解方法至關重要[9]。

1.2.1 離子液體溶解體系

離子液體是指全部由離子組成的、沒有電中性分子的環保試劑。具有優異的溶解性、熱穩定性、強極性、不揮發、難氧化和可設計性等優點，具有“需求特定”和“量體裁衣”等稱號。近年來，離子液體在溶解高聚物方面備受關注[10]。任厚朋等[11]組合了十種離子液體，其中離子液體1-丁基-3-甲基咪唑乙酸鹽（[Bmin]AC）在75 ℃下，840 min內對絲素蛋白的最大溶解能力可達到15%，為絲素蛋白的溶解和應用提供參考；王宗乾等[12]采用1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[Amim]Cl）離子液體共溶法制備絲素蛋白/聚乙烯醇（SF/PVA）復合膜，隨著復合膜中絲素蛋白含量的增加，復合膜的親水性能提升。采用[Amim]Cl離子液體共溶提高了絲素蛋白與聚乙醇組分的相容性，且使用后的[Amim]Cl離子液體可經過旋蒸回收，實現重復使用，具有環保效益。

1.2.2 中性鹽溶解體系

絲素在水中只能有限膨潤，但在部分高濃度中性無機鹽溶液中卻能無限膨潤，最終完全溶解[9]。肖露等[13]選用中性溶劑高濃度鹽、鹽與有機液體的多元溶劑，分別對桑蠶絲和柞蠶絲進行溶解，在CaCl2-H2O-C2H5OH溶解體系下，桑蠶絲素的溶解最佳，而Ca(NO3)2-4H2O體系下則更有利于柞蠶絲素的溶解。在不同溶解體系下制備的絲素溶液不但分子量分布與穩定性不同，而且氨基酸含量也有所差異；甘潤生等[14]采用兩種不同的溶解體系對脫膠后的蠶絲蛋白纖維進行溶解，制備了絲素蛋白納米顆粒。其中CaCl2-H2OC2H5OH-FA溶解體系有助于形成球狀絲素蛋白納米顆粒，且制備出的絲素蛋白納米顆粒粒徑均一、分布均勻。

2 蠶絲的再生加工

絲素蛋白材料雖然具有良好的生物相容性和可降解性，在生物醫用領域的應用前景甚廣，但是純絲素蛋白材料在生物醫用領域的應用方面，其力學性能等尚未達到實用性的要求，而絲素蛋白的改性研究是一種良好的解決途徑。

2.1 物理改性

采用物理改性方法，不但可以改善蠶絲的光澤，提高蠶絲纖維的力學性能，而且還可以使蠶絲獲得更好的熱穩定性、阻燃性、抗皺、抗菌以及色牢度等性能。常用的物理的改性方法有有機溶劑誘導改性、輻照改性、熱處理改性、等離子體技術等[15]。王心如等[16]以柞蠶絲為原料，采用乙醇誘導再生柞蠶絲素蛋白（ASF）溶液快速凝膠，從而進一步制備ASF多孔材料。隨著乙醇水溶液濃度的升高，不僅可以使凝膠中β-折疊含量上升，而且有利于獲得孔徑較大的ASF多孔材料。在該材料上接種血旺細胞后的結果表明，ASF多孔材料在生物醫用領域具有一定的應用價值；馮美林等[17]將制備的納米羥基磷灰石溶液通過空氣等離子體處理，成功制備出絲素纖維/納米羥基磷灰石復合材料。該處理不僅增加了絲素纖維的表面粗糙度，而且改變了絲素纖維表面的親疏水性及結晶度。其制備的絲素纖維/納米羥基磷灰石復合材料有望用于骨組織修復替代材料，為骨缺損修復提供了一定的解決依據。

2.2 化學改性

絲素蛋白分子具有相當數量的絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基，可以通過常規的化學方法進行修飾和交聯改性，目前常見的交聯劑主要有環氧樹脂、戊二醛、京尼平和碳化二亞胺等。汪巍巍等[18]使用碳化二亞胺（EDC）為激活劑，介導柞蠶絲素蛋白側鏈上的羧基與低分子量聚乙烯亞胺（PEI）上的氨基反應，使得做蠶絲素蛋白表面的電荷由負電荷轉為正電荷，從而獲得陽離子改性后的柞蠶絲素蛋白。低分子量的PEI改性的柞絲素蛋白有可能是一種新基因傳遞載體。

2.3 共混改性

共混改性，即將絲素蛋白溶液直接加入天然或合成的高分子溶液均勻攪拌后共混成膜。高分子材料可以與絲素蛋白通過羰基和其他極性基團形成氫鍵，誘導絲素蛋白分子鏈結構發生改變，從而提高絲素蛋白材料的力學性能，改善其吸水性[19]。YANG等[20]研究了明膠（G）對絲素蛋白（SF）膜進行改性，探討其作為細胞生長生物材料是否能提高絲素表面的生物相容性。研究結果表明，共混處理后的絲素蛋白膜細胞相容性顯著增強，且無細胞毒性。SF/G共混膜在組織工程和生物醫學工程中具有潛在的應用潛力，在組織工程和生物醫學工程中，在物理和生物工程領域，SF/G共混膜都體現出其良好的應用前景；王一川等[21]采用靜電紡絲技術制備了具有一定取向的絲素蛋白-聚乙烯醇共混納米纖維材料，改善了納米纖維材料的力學性能，提高了該材料應用于組織工程支架材料時，細胞的生長及增殖等性能。

3 絲素蛋白在生物醫用材料領域的應用形式

3.1 絲素蛋白膜

絲素蛋白具有良好的成膜性能，因此，在生物醫用領域再生絲素膜是一種常見的應用形式之一。全君杰等[22]運用絲素蛋白、殼聚糖和羥基磷灰石為原料，制備出具有良好生物相容性及一定骨誘導性的復合生物膜，該復合生物膜有望成為一種新型的生物膜材料；趙彬等[23]在此前的研究基礎上，將氧化石墨烯/絲素蛋白（GO/SF）生物材料以屏障膜的形式用于引導性骨再生領域。采用冷凍干燥技術制備負載辛伐他汀（SIM）的GO/SF復合屏障膜，經過釋藥性能檢測及體內外實驗后發現，該復合屏障膜具有緩釋效果和最優的骨缺損修復效果。

3.2 絲素蛋白支架

在組織工程研究中，絲素蛋白支架不但可以為新生組織提供相應的力學支持，而且因其植入機體內具有良好的生物相容性、可降解性及低免疫原性等優勢，使得絲素蛋白支架在生物醫用領域方面受到人們的廣泛關注和應用。陳飛揚等[24]研究通過靜電紡絲技術對絲素（SF）和殼聚糖（CS）進行混紡，制備的SF/CS復合納米纖維膜支架具有良好的生物相容性，CS很好地促進人骨髓間充質干細胞成骨分化，使得SF/CS復合支架在骨組織再生方面成為可能；陳琦等[25]在濃縮生長因子（CGF）-絲素蛋白/羥基磷灰石類骨質復合生物支架進行兔頜骨缺損修復中，發現該復合支架具有良好的骨誘導性，在生物醫用材料領域有望成為新型的骨缺損修復材料。

3.3 絲素蛋白水凝膠

絲素蛋白因其特殊的大分子結構，使得能通過加工制備成絲素蛋白水凝膠，是再生絲素的一種重要表現形式，其具有高含水量和高度交聯的空間網絡結構，獨特的理化性質和對細胞和小分子優異的透過性和擴散性[26]。制備的絲素蛋白水凝膠已在生物醫用領域得到了廣泛的應用。CHEN等[27]提出了一種新型的具有三維（3D）各向異性和定向的凝膠骨架/網絡形態的絲素蛋白/枯草菌脂肽鈉水凝膠，由于其定向的凝膠骨架/網絡結構和顯著增強的機械性能，剪切誘導的絲蛋白/表面活性素凝膠可能適合作為3D定向組織再生的生物材料，包括用于神經、骨細胞的培養以及修復缺損等研究中；ZHOU等[28]合成了具有乙烯基的馬來酰化殼聚糖（MCS）和甲基丙烯酸化絲素蛋白（MSF）微/納米顆粒。通過研究得出，其具有作為組織工程支架修復軟骨的潛力。

3.4 絲素蛋白微球

絲素微球因具有生物相容性好、可生物降解、比表面積大、分散性好等優點，是藥物運輸系統的理想材料[29]。絲素微球的制備方法主要有乳化法、噴霧干燥法、層流射流技術及自主裝法等。葉漫文等[30]試圖用不同濃度京尼平交聯不同絲素蛋白（SF）與殼聚糖（CS）比例，制備SF/CS復合微球并包載牛血清蛋白（BSA）。SF/CS復合微球的緩釋效能優于單純的殼聚糖微球，使得該復合微球在藥物轉運方面成為可能；徐幫會等[31]運用星點設計法，以絲素蛋白溶液為水相，以液體石蠟為油相，以戊二醛為交聯劑，以Span80為乳化劑，應用乳化-化學交聯法制備絲素蛋白微球圓整，為絲素蛋白微球在藥物載體方面的研究提供一定的理論依據。

4 總結與展望

絲素蛋白作為一種天然的高分子蛋白質，與其他合成材料相比，具有良好的生物相容性、可生物降解及可塑性等眾多優勢，使得絲素蛋白材料在生物醫學材料領域受到了廣泛的關注和重視。目前，絲素蛋白已成功應用于骨組織支架、血管組織再生、皮膚修復等過程中。然而面對復雜的醫學應用要求，絲素蛋白材料從提取、加工及在生物醫用領域依然存在許多問題亟需解決。譬如，如何選擇合適的脫膠劑和脫膠條件，用以解決脫膠過程中對絲素力學性能和蛋白質分子量降低的影響；如何調控絲素蛋白的降解速率，使得絲素蛋白材料的功效發揮到極致。解決這些問題，還需要國內外學者的不懈努力。總體來講，絲素蛋白材料在生物醫用材料領域還具有較大的探索提升空間，相信經過國內外學者的不懈努力，一定可以使得絲素蛋白材料在生物醫用材料領域發揮更大的作用。