通過LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信號通路探討酒精性肝病發病機制

牟文玲 陳事如 吳振婷 常鴻杰 馮夢瑤 周航 胡立華

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于長期大量飲酒導致的一組肝臟疾病的總稱。世界各國的發病率和隨之帶來的經濟負擔均隨著社會經濟發展呈上升趨勢[1-4]，是國內外肝臟疾病研究的重點，酒精已成為繼病毒性肝炎后導致肝臟損害的第二大病因，ALD正在成為威脅人類健康的全球性公共衛生問題，對其發病機制的探索和研究刻不容緩。ALD做為臨床常見的肝臟疾病，因其發病機制不明，一直缺乏行之有效的治療。一旦發病過程中的扳機機制啟動，患者即使嚴格忌酒，仍無法控制疾病的進程。而臨床多采取簡單的保肝降酶對癥治療，無法從根本控制或逆轉肝臟病理生理改變。如明確LPS-TLR4/MD-2-TNF-α通路的作用環節以及該信號通路在酒精性肝損傷中的作用機制，可為篩選治療ALD的分子靶點提供實驗依據，本課題從體外、體內兩方面研究探討該信號通路的影響和作用機制，同時選擇性阻斷LPSTLR4/MD-2-TNF-α信號通路分子，探討該通路在ALD中的作用機制。為防治ALD提供科學依據并為尋找新的治療靶點提供理論基礎和研究方向。

1 資料和方法

1.1 一般資料

SD雄性大鼠，ALD大鼠尾靜脈注射內毒素LPS 50 μg/kg，鼠重90 min。選擇性體內阻斷劑分別應用大鼠anti-TLR4、anti-MD-2（以上來自Abcam公司）經腹腔注射治療。試劑：40%酒精、50%酒精、水合氯醛、選擇性體內阻斷劑。儀器設備：超速和高速離心機；PCR儀；電轉移儀；芯片掃描儀、芯片雜交儀、自動基因序列分析儀、DNA合成儀、凝膠成相分析儀，高效液相分析儀，基因芯片點樣儀、自動基因序列分析儀、-80℃低溫冰箱和Parmacia電泳儀等。

1.2 研究方法

1.2.1 體內研究 將大鼠適應性飼養1周后，大鼠按每周測定的體質量每日早晚各給予1次白酒灌胃，前4周每日給予40%酒精灌胃（8 g/kg），2次灌胃時間間隔超過8 h，自第5周開始，每日給予50%酒精灌胃（9 g/kg），至8周末。任取灌胃8周末一只大鼠禁食12 h后，以10%的水合氯醛3 mL/kg進行麻醉，取血液離心采用分光光度法分別檢測血清ALT、AST、ALP、GGT、TCH、TG、TB。取出肝臟，用于常規石蠟包埋切片，常規HE染色并觀察其肝臟的組織學改變及超微結構的改變、備用。

觀察項目：

（1）取肝臟進行組織培養并測定培養液中TNF-α的含量：取肝組織約10 mm×4 mm×0.4 mm，在冰浴的William's E medium培養液中洗去血液，放入含10%小牛血清的William's E medium培養液中進行組織培養（5%CO2，18%O2，37℃），每個培養瓶中放入兩塊上述大小的肝組織。取不同時間點（0 h，1 h，2 h）的培養上清測定TNF-α的含量（以每克組織定量），并測量培養瓶中的肝組織重量。

（2）肝組織中LBP、CD14、TLR4、MD-2、TNF-α蛋白表達變化：Western blot方法檢測。

（3）肝組織中LBP、CD14、TLR4、LBP、MD-2、TNF-α m RNA表達：real time RT-PCR方法檢測。

（4）肝組織中NF-κB活性：Western blot和EMSA方法檢測。肝組織學損害用HE、PAS和Masson’s染色病理切片進行評估。

1.2.2 體外研究 分離ALD大鼠模型肝臟Kupffer，常規建立細胞培養體系。分別采用TLR4/MD-2過表達慢病毒載體及RNAi轉染肝臟Kupffer，檢測Kupffer表型及功能的變化、TLR4/MD-2通路相關分子的表達變化以及細胞因子產生的變化。

1.3 觀察指標

選擇表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒（lentivirus）載體包裝質粒：pRsv-REV、pMDlg-pPRE和pMD2G包裝質粒，同時分別構建含TLR4和MD-2特異性siRNA序列的質粒，用表達相應基因的siRNA病毒分別感染肝臟Kupffer細胞，分別干擾TLR4和MD-2的表達。以表達無功能siRNA慢病毒為陰性對照。以實時定量RT-PCR和Western blot檢驗慢病毒siRNA的基因沉默效果，每個基因設計2～3條siRNA，選取基因沉默效果最佳者進行實驗。用流式細胞儀檢測表達GFP細胞比例，監測慢病毒對細胞的感染效率。

1.4 統計學方法

臨床觀察記錄、臨床試驗資料和數據由專人管理。計量資料組內前后對照采用配對t檢驗，采用（±s）表示，組間差異顯著性采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K檢驗。計數資料用χ2檢驗，采用（n，%）表示，相關分析采用Pearson相關系數或者Spearman秩相關系數，統計分析用SPSS 20.0統計軟件包進行。

2 結果

實驗發現：在顯著性差異表達的Pathway中LPS代謝通路呈上調趨勢，且有多個差異miRNA同時調控此代謝通路。同時選擇性阻斷LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信號通路分子，可以降低乙醇在肝細胞內代謝產生的毒性代謝產物及引起的代謝紊亂，減緩炎癥反應引起的損傷。

3 討論

內毒素主要成分是脂多糖（LPS），是腸道革蘭氏陰性細菌外膜的重要組成成分，在菌體自溶或被裂解時釋放出來。長期大量的飲酒，可刺激腸道致損傷，使腸道菌群上移，引起內毒素腸滲漏，使血中內毒素含量升高，即腸肝循環。臨床研究表明，酒精性肝病患者血漿內毒素水平較正常受試者及非酒精性肝硬化患者升高，動物實驗亦有類似結論[5-7]。現有研究支持LPS—Kupffer細胞活化—TNF-α等細胞因子分泌—肝臟炎癥損傷這一途徑：即LPS進入血液后，通過LPS的結合蛋白LBP與Kupffer細胞膜表面的內毒素受體（endotoxin receptors on Kupffer cell membrane，CD14）結合，經跨膜受體TLR4等Toll樣受體家族（Toll like receptors，TLRs）參與，完成LPS跨膜信號轉導進入胞內，激活肝Kupffer細胞，使存在于胞漿的I-κB磷酸化釋放NF-κB（nuclear factor-kappa B）。NF-κB進入細胞核，與靶基因啟動子區域的特定序列結合，從而啟動炎癥因子如腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor-α，TNF-α）的轉錄。TNF-α等促炎因子的存在又可進一步活化NF-κB，形成惡性循環。TNF-α是Kupffer細胞活化產生的主要炎癥細胞因子，通過其受體TNFR1發揮多種細胞效應，如通過活化內皮細胞發揮促中性白細胞聚集的效應，誘導細胞線粒體腫脹、破壞及細胞凋亡壞死，從而發生肝損傷。

新近的研究發現TLR4介導的LPS信號轉導需要一種稱為髓 樣 分 化 蛋 白 -2（myeloid differentiation protein-2，MD-2） 的輔助[8-13]：血漿中的LPS首先和肝臟產生的LPS結合蛋白（LPS binding protein，LBP）結合，由LBP將LPS轉運到CD14（cluster of differentiation-14）。但是CD14缺乏跨膜區和胞漿內段，不能將LPS信號轉導到細胞內，因此它只能將LPS傳遞給下游的TLR4/MD-2受體復合物。最近研究報道LPS可上調Kupffer細胞中TLR4/MD-2基因和蛋白的表達，并合成細胞因子TNF-α，抗TLR4的抗體能抑制LPS誘導的TNF-α的生成，TLR4/MD-2單克隆抗體可以保護肝臟免于LPS引起的致死性肝損傷。TLR4和它伴侶分子MD-2可能在LPS—Kupffer細胞活化—TNF-α等細胞因子分泌—肝臟炎癥損傷這一途徑中發揮受體結合、促細胞因子分泌的重要作用。

本課題從體外、體內兩方面研究：體外觀察LPS誘導kuffer細胞產生TNF-α的干預的作用和強度。體內研究采用大鼠LPS尾靜脈注射誘導TNF-α釋放的模型，分離肝臟進行體外組織培養，探討該信號通路的影響和作用機制，同時選擇性阻斷LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信號通路分子，探討該通路在ALD中的作用機制。實驗發現：在顯著性差異表達的Pathway中LPS代謝通路呈上調趨勢，且有多個差異miRNA同時調控此代謝通路。

綜上所述，通過體內特異性單抗阻斷LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信號通路可以降低乙醇在肝細胞內代謝產生的毒性代謝產物及引起的代謝紊亂，減輕炎癥反應引起的損傷。本課題可為篩選治療ALD的分子靶點提供實驗依據，為防治ALD提供科學依據并為尋找新的治療靶點提供理論基礎和研究方向。