羊肚菌母種培養(yǎng)基比較試驗(yàn)

冉永紅 馬琳靜 謝淑琴 張 旦 魏鏞頻

（1定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅定西 743000；河南省南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南南陽(yáng) 473002）

羊肚菌（Morchella）是一類名貴的食藥用真菌，因其高蛋白、低脂肪，富含氨基酸和維生素，味道鮮美而深受人們歡迎[1]。彭璐等[2]研究表明，新疆天山山腳下葡萄園中采集的羊肚菌分離菌株適宜在黃豆芽-玉米粉-黃豆粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。黃冕等[3]研究表明，胡蘿卜和黃豆粉培養(yǎng)基培養(yǎng)尖頂羊肚菌母種，可縮短制種周期，且母種質(zhì)量好。孟俊龍等[4]人工栽培小羊肚菌試驗(yàn)表明：M2（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，KH2PO43 g，MgSO40.5 g，楊樹(shù)根際土25 g，蛋白胨2 g，水1 000 mL）為最佳母種培養(yǎng)基。任愛(ài)梅等[5]對(duì)采自甘肅省的一株野生羊肚菌進(jìn)行分離培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明：菌絲在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，在綜合PDA 培養(yǎng)基上菌落干重最高。杜忠偉等[6]對(duì)采自吉林省延邊朝鮮族自治州的一株羊肚菌菌株培養(yǎng)結(jié)果表明：該菌株菌絲在黃豆芽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，其次是PDA 培養(yǎng)基。侯軍等[7]研究表明，不同的羊肚菌品種（菌株），在不同的培養(yǎng)基上，其菌絲的形態(tài)、顏色等各異。為此，筆者進(jìn)行了11 個(gè)母種培養(yǎng)基培養(yǎng)一株六妹羊肚菌（甘肅人工栽培羊肚菌菌株）的比較試驗(yàn)，以期為當(dāng)?shù)貐^(qū)羊肚菌母種培養(yǎng)基選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試菌株：甘肅省科學(xué)院生物研究所保藏的六妹羊肚菌菌株，編號(hào)M61。

（2）供試培養(yǎng)基

試驗(yàn)設(shè)計(jì)了11 個(gè)母種培養(yǎng)基配方。配方1：馬鈴薯50 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，磷酸二氫鉀0.25 g，蛋白胨0.25 g；配方2：馬鈴薯50 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.125 g，蛋白胨0.25 g；配方3：馬鈴薯50 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，木屑12.5 g；配方4：馬鈴薯50 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，麩皮12.5 g；配方5：葡萄糖5 g，瓊脂5 g，磷酸二氫鉀0.115 g，磷酸氫二鉀0.25 g，硫酸鎂0.125 g，蛋白胨0.5 g，酵母粉0.5 g；配方6：葡萄糖5 g，瓊脂5 g，磷酸二氫鉀0.25 g，蛋白胨0.25 g，酵母粉0.125 g，玉米粉2.5 g；配方7：葡萄糖5 g，瓊脂5 g，酵母粉1 g，麥芽膏2.5 g，羊糞粉5 g；配方8：馬鈴薯25 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，腐殖土25 g；配方9：葡萄糖5 g，瓊脂5 g，蛋白胨0.25 g，酵母粉0.125 g，新鮮松針60 g；配方10：蘋果50 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，磷酸二氫鉀0.25 g，蛋白胨0.25 g；配方11：生梨50 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，磷酸二氫鉀0.25 g，蛋白胨0.25 g，純凈水250 mL，pH自然。

培養(yǎng)基配制方法。配方1、配方2、配方3、配方4：馬鈴薯去皮、切塊，各取50 g 分別加純凈水400 mL 煮25 min，用4層紗布過(guò)濾，取濾液后對(duì)應(yīng)移至1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)錐形瓶中，加純凈水定容至250 mL，再加入其他組分，用玻璃棒邊攪拌邊加熱，使之完全溶化后待用。配方5：加250 mL 純凈水至5 號(hào)錐形瓶中，加入其他組分，用玻璃棒邊攪拌邊加熱，使之完全溶化后待用。配方6：將玉米粉加入400 mL 純凈水煮25 min，用4層紗布過(guò)濾，取濾液后移至6號(hào)錐形瓶中，加純凈水定容至250 mL，加入其他組分，用玻璃棒邊攪拌邊加熱，使之完全溶化后待用。配方7：將羊糞粉加入400 mL 純凈水煮25 min，用4 層紗布過(guò)濾，取濾液后移至7 號(hào)錐形瓶中，加純凈水定容至250 mL，加入其他組分，用玻璃棒邊攪拌邊加熱，使之完全溶化后待用。配方8：將腐殖土加入400 mL 純凈水煮25 min，用4 層紗布過(guò)濾，取濾液后移至8 號(hào)錐形瓶中，加純凈水定容至250 mL，加入其他組分，用玻璃棒邊攪拌邊加熱，使之完全溶化后待用。配方9：將新鮮松針加入400 mL 純凈水煮25 min，用4層紗布過(guò)濾，取濾液后移至9號(hào)錐形瓶中，加純凈水定容至250 mL，加入其他組分，用玻璃棒邊攪拌邊加熱，使之完全溶化后待用。配方10、配方11：將蘋果和梨去皮、去芯、切塊，分別加純凈水400 mL 煮25 min，用4 層紗布過(guò)濾，取濾液后對(duì)應(yīng)移至10號(hào)、11號(hào)錐形瓶中，加純凈水定容至250 mL，加入其他組分，用玻璃棒邊攪拌邊加熱，使之完全溶化后待用。將上述1～11號(hào)錐形瓶放入高壓滅菌鍋中滅菌，滅菌條件：121 ℃，0.1 MPa，30 min。培養(yǎng)基溫度冷卻至50 ℃時(shí)，在純凈工作臺(tái)中倒入90 mm 平皿中，每個(gè)平皿倒20 mL培養(yǎng)基，冷卻后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種制備

參照任愛(ài)梅等方法[5]，將已活化好的試管斜面菌種接種至90 mm 的PDA 培養(yǎng)基平板上，20 ℃避光恒溫培養(yǎng)4 d（96 h），用6 mm 打孔器取菌絲體塊，分別接種于上述11個(gè)母種培養(yǎng)基平板上。

1.2.2 菌絲體培養(yǎng)特征觀察

參照董雪方法[8]，將上述轉(zhuǎn)接菌絲體塊的11 個(gè)母種培養(yǎng)基平板置20 ℃避光恒溫培養(yǎng)。每隔24 h觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)、氣生菌絲密度以及菌絲顏色，當(dāng)菌絲體即將長(zhǎng)滿并未長(zhǎng)滿平皿時(shí)，以接種塊為中心用刻度尺測(cè)量菌落直徑（mm）。設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)測(cè)量3次，取平均值。計(jì)算菌絲日均長(zhǎng)速：

1.2.3 菌絲干重測(cè)定

參照董雪[8]及謝放等[9]方法，菌絲體培養(yǎng)4 d（96 h）時(shí)，連同母種培養(yǎng)基一同放入盛有蒸餾水的燒杯中，加熱至培養(yǎng)基完全熔化，用玻璃棒挑出菌絲后蒸餾水漂洗3次，濾紙吸收多余的水分，于電熱鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃烘至恒重后稱重，取3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 菌核培養(yǎng)特征觀察

參照鄭磊等[10]及劉福陽(yáng)等[11]方法，每隔24 h 觀察記錄母種培養(yǎng)基上菌核形成的時(shí)間；培養(yǎng)20 d（480 h）時(shí)，觀察記錄菌核分布區(qū)域、菌核顏色變化和菌核數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試母種培養(yǎng)基上培養(yǎng)羊肚菌（M61）菌絲體特征

由表1、圖2 可知，供試母種培養(yǎng)基上羊肚菌菌絲體培養(yǎng)結(jié)果存在較大差異。配方8菌絲體平均長(zhǎng)速最快，配方4次之，配方5最慢；配方2菌絲干重最高，配方1 次之，配方7 最低。菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好的是配方4、配方6、配方8、配方11，配方9 最差。配方7 氣生菌絲稠密，氣生菌絲稀疏的是配方6、配方8、配方11，配方4、配方10 氣生菌絲較密，配方1、配方2、配方3、配方5 氣生菌絲濃密。菌絲形態(tài)最好的是配方8、配方10、配方11，配方4、配方6次之，最差的是配方1、配方9。

綜上所述，菌絲生長(zhǎng)最好的培養(yǎng)基為配方8、配方11，配方4、配方6次之，配方9最差。

表1 供試母種培養(yǎng)基培養(yǎng)羊肚菌（M61）菌絲體結(jié)果

圖1 供試母種培養(yǎng)基培養(yǎng)羊肚菌（M61）菌絲體特征（20 ℃，培養(yǎng)4 d）

2.2 供試母種培養(yǎng)基上羊肚菌（M61）菌核形成及生長(zhǎng)發(fā)育情況

由表2、圖2 可知，配方2、配方10、配方11 同一天產(chǎn)核，且產(chǎn)核最早，其次配方1、配方3、配方6、配方9，配方5 產(chǎn)核時(shí)間最晚，配方8 沒(méi)有產(chǎn)核。配方11 產(chǎn)核數(shù)量最多，顆粒狀菌核密集分布于整個(gè)平皿。配方2、配方10 產(chǎn)核數(shù)量次之，其中配方10 顆粒狀菌核密集分布于整個(gè)平皿，而配方2 片狀菌核分散分布于接種塊周圍。配方5 產(chǎn)核數(shù)量最少，杏黃色點(diǎn)狀菌核分散分布于接種塊周圍。從羊肚菌菌核形成特征來(lái)看，配方11最佳，其次是配方10，配方8不產(chǎn)核。

表2 供試母種培養(yǎng)基上羊肚菌（M61）菌核形成及生長(zhǎng)發(fā)育

圖2 供試母種培養(yǎng)基培養(yǎng)羊肚菌（M61）20 d時(shí)的菌核狀態(tài)（培養(yǎng)溫度20 ℃）

3 小 結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，供試11個(gè)母種培養(yǎng)基對(duì)羊肚菌（M61）菌絲生長(zhǎng)和菌核形成有顯著影響。菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，氣生菌絲少，菌核形成能力強(qiáng)且顆粒狀密集分布于整個(gè)培養(yǎng)基為優(yōu)質(zhì)菌種表觀特征。基于此，配方11（生梨50 g，葡萄糖5 g，瓊脂5 g，磷酸二氫鉀0.25 g，蛋白胨0.25 g，純凈水250 mL，pH 自然）為試驗(yàn)六妹羊肚菌最佳母種培養(yǎng)基。