不同培養基上羊肚菌菌株產無性孢子觀察

祁 鵬 張黎光 戴 璐 路鵬鵬 劉 愚 喬 婷 陳世明 李峻志*

（1陜西省微生物研究所，陜西西安 710043；2陜西寧陜縣秦南菌業科技有限公司，陜西安康 711699）

羊肚菌隸屬子囊菌門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科，是一類世界性分布食藥兼用的珍稀菌類[1-4]。文獻記載，1990 年，VOLK、LEONARD[5]描述了羊肚菌無性孢子，并指出羊肚菌可能經歷兩種不同的生活史途徑。2007 年，PILZ[6]報道并描繪了羊肚菌的無性孢子的形態，但缺乏更加詳盡的影像資料。直到2010 年，MASAPHY 通過電子掃描顯微鏡觀察并首次報道了紅褐羊肚菌（Morchella rufobrunnea）的無性孢子[7]。但迄今為止，國內關于羊肚菌無性孢子的相關研究仍然較少。

筆者所在團隊自1999年起開始研究羊肚菌，多年來積累了一定的羊肚菌種質資源和技術成果[8-12]。羊肚菌人工栽培及其他試驗過程中均出現無性孢子的現象（即“菌霜”），但國內針對羊肚菌無性孢子的研究和微觀描述目前較少，且是否所有羊肚菌均能夠產生無性孢子尚不清楚。為此，筆者隨機觀察記錄了5 株不同來源的羊肚菌菌株在3 種培養基上菌絲生長、產孢情況及孢子的微觀特征，期望有助于我國羊肚菌的人工栽培技術研究和商業化開發。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

羊肚菌菌株隨機選自陜西省微生物研究所秦嶺菌物標本館（SXIM），分離純化后，編號M1、M2、M3、M4、M5保藏。

表1 供試羊肚菌菌株及來源

1.2 供試培養基

根據羊肚菌的生態特點，設計3種培養基，分別編號為①、②、③。①PDA 培養基。②木屑培養基：細木屑90%，麩皮9%，硫酸鎂1%。培養料含水量55%～60%，pH 自然。拌料后裝入培養皿中，厚度8～10 mm，121 ℃滅菌20 min。③腐殖土培養基：將腐殖土篩去石頭和樹枝后，按照1∶1 質量比加入細沙土，培養料含水量40%～50%，pH 自然。拌料后裝入培養皿中，厚度8～10 mm，121 ℃滅菌120 min。

1.3 供試菌株的培養

將M1、M2、M3、M4、M5 菌株的純培養物分別接種于PDA培養基平板上，置于培養箱中20 ℃恒溫培養3～5 d，待菌絲即將長滿平板時，取出備用。

1.4 供試羊肚菌菌株在3 種培養基上菌絲生長及無性孢子觀察

用打孔器在M1、M2、M3、M4、M5 菌株的固體培養基平板上的菌落邊緣區域，均勻打取直徑6 mm的菌絲體塊，分別接種于供試培養基①、②、③上，并在每個接種后的平板插入無菌的蓋玻片，25 ℃恒溫培養6～8 d 后[13]，采用奧林巴斯BX43 生物顯微鏡觀察并記錄。

2 結果與分析

2.1 供試羊肚菌菌株在3種培養基上菌絲生長狀況

供試羊肚菌菌株在3種培養基上菌絲都能夠很好的生長，但只有M2、M4菌株在培養基③上產生無性孢子。

表2 供試羊肚菌菌株在3種培養基上的菌絲生長狀況

2.2 供試羊肚菌菌株在3 種培養基上產無性孢子觀察結果

供試羊肚菌菌株在3 種培養基上培養6～8 d，在培養基③上，M2、M4 菌株率先產生無性產孢結構并產生無性孢子，其余菌株及培養基上，即使培養30 d仍未產生無性孢子。

由此可見，3 種培養基中，培養基①和培養基②不適合作為羊肚菌產孢的培養基，培養基③可作為羊肚菌產孢培養基。

就5 株供試羊肚菌菌株而言，M2、M4 菌株在培養基③上都產生了無性孢子，而在培養基①和②上均未產生無性孢子；M1、M3、M5 菌株在3 種培養基上均未產生無性孢子，因此推測這3 株羊肚菌繁殖不存在無性孢子階段，與M2、M4菌株的生長發育階段差異較大。

2.3 供試M2、M4菌株無性孢子的顯微結構

在顯微鏡下觀察M2 與M4 羊肚菌菌株無性產孢結構，未發現無性產孢結構存在明顯差異。2 株羊肚菌菌株均在氣生菌絲的頂端產生無性產孢結構，該結構均具備明顯分化的孢子梗，一、二級分枝，分支末端即為小梗，小梗以輪狀著生于分支菌絲上，每輪有3～6個小梗，在每個孢子梗的頂端以出芽方式產生1～2 個無性孢子。小梗長度為8～12 μm，無性孢子直徑3～5 μm。無性孢子圓球形至橢圓球形，光滑，無色透明，單核，有油滴（圖1）。

圖1 M2、M4羊肚菌菌株無性孢子梗及無性孢子

3 小結與討論

羊肚菌在石灰巖、白堊質土壤、腐殖土、黑黃色壤土、沙泥混合土、沙壤土中均能夠生長。供試5株羊肚菌菌株在3種培養基上都能夠很好地進行營養生長，也驗證了羊肚菌菌絲具備較強生長能力，能夠從多種不同的營養基質中獲取營養，這可能是其在全世界范圍內分布較廣泛的重要原因。

供試菌株M2（尖頂羊肚菌）和M4（梯棱羊肚菌）在培養基③上產生了無性孢子，這一共同發育階段，表明這兩個種在進化過程中具備更近的親緣關系，該特征或許可作為部分種屬羊肚菌分類和鑒定的微觀依據。供試粗腿羊肚菌菌株未見到無性孢子階段，但不影響其在野外的正常生長和發育，可能其不存在無性孢子的生長發育階段。目前對尖頂羊肚菌等無性孢子產生的作用、機理以及與羊肚菌子囊果發生的關系尚不明確。針對羊肚菌生活史和系統發育過程，筆者將會繼續進行研究探索，并期望通過研究為羊肚菌人工馴化及穩產提供科學依據。