原生質體再生法復壯秀珍菇菌株初探

崔 曉 叢倩倩 王慶武

（泰安市農業科學研究院食用菌研究所，山東泰安 271000）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius）學名為肺形側耳[1]，20 世紀后期由我國臺灣省引進并推廣[2]，其營養豐富，蛋白質高于香菇、草菇，且纖維含量少，口感脆嫩鮮美，深受歡迎[3]。秀珍菇的擴大再生產需要菌種的多次擴繁，而多次擴繁會導致菌種退化，子實體的質量和產量下降等問題隨之而來。常見的復壯方法如挑取不同部位菌絲、組織分離、改良培養基配方等的效果不佳[4-8]，國內外鮮有利用原生質體再生的方法復壯秀珍菇的研究報道。筆者首次通過原生質體再生的方法復壯秀珍菇，旨在驗證該方法在秀珍菇菌株復壯的有效性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

秀珍菇菌株秀-T。經多次擴繁后，該菌株有母種在平板上出現角變，擴繁種長速變慢甚至停止生長，出菇試驗產量下降等退化現象。

1.2 母種培養基配方

PDA 培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，瓊脂20 g，加水定容至1 L。每個平板定量為20 mL。

TB3 再生培養基：酸水解酪蛋白3 g，酵母提取物3 g，蔗糖200 g，葡萄糖10 g，瓊脂8 g，加水定容至1 L。

1.3 原生質體制備與再生

供試秀-T 菌株原生質體制備與再生的方法參考文獻[9]。

1.4 秀珍菇栽培試驗

以出發菌株為對照，進行復壯秀珍菇菌株栽培試驗，每處理重復3次。聚乙烯塑料折角袋裝料（約裝干料400 g），高壓高溫（115 ℃）滅菌8 h，待料溫降至25 ℃以下，按無菌操作規范兩端接種。栽培試驗配方及管理參照文獻[10]。記錄菌絲滿袋期、現原基時間、子實體形成時間、第1 潮采收時間，計產并計算生物學效率。

1.5 菌絲長速測定

母種以“十字交叉法”測量平板中菌絲直徑并計算菌絲長速，原種及栽培種采用“劃線法”測量并計算菌絲長速。每處理重復10次。

1.6 酶活性定義及復壯菌株酶活性測定

測定復壯菌株的羧甲基纖維素酶（CMC 酶）、木聚糖酶、漆酶活性，以出發菌株為對照（CK）。酶活性測定方法參考文獻[11]。

酶活性定義：特定條件下，1 L 酶液1 min 內轉化生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量，稱為一個國際單位（U）。酶活性用X表示，單位為酶活性單位每升（U/L）。木聚糖酶、CMC 酶活性計算參照文獻[12]。

1.7 標準曲線繪制

（1）葡萄糖標準曲線繪制

準確稱取0.1 g 烘干后的葡萄糖，溶于水中，定容至100 mL 備用。將不同濃度的葡萄糖溶液與DNS 試劑反應，530 nm 測OD 值，繪制葡萄糖標準曲線[11]。

（2）木糖標準曲線繪制

準確稱取0.1 g 烘干后的木糖，溶于水中，定容至100 mL 備用。將不同濃度的木糖溶液與DNS 試劑反應，530 nm 測OD 值，繪制木糖標準曲線[11]。

1.8 數據處理

相關數據采用Excel 2010 進行整理并進行方差分析。采用Duncan’s 新復極差法統計分析。

1.7 得到葡萄糖標準曲線回歸方程為：y=0.9922x+0.0595，R2=0.9924;木糖標準曲線回歸方程為：y=0.9106x+0.047，R2=0.9932。

2 結果與分析

2.1 原生質體再生菌株篩選

2.1.1 原生質體再生雙核菌株鏡檢

秀珍菇菌株原生質體再生后，挑取的35個再生菌落中，通過分離培養及鏡檢獲得20個具有明顯鎖狀聯合（圖1）的雙核菌絲體。

圖1 鎖狀聯合結構（箭頭所指）

2.1.2 原生質體再生菌株初步篩選

將出發菌株與原生質體再生得到的20 株雙核菌株分別接種于平板培養基中觀察，結果見表1。

由表1 可知，Re-1、Re-2、Re-5、Re-6、Re-9 這5株再生菌株具有明顯生長優勢。

2.2 出菇試驗

2.2.1 再生菌株擴繁種生長情況

由圖2、表2可知，經再生復壯后的菌株，其原種和栽培種的菌絲平均長速均高于出發菌株。原種菌絲平均長速依次為：Re-5＞Re-6＞Re-2＞Re-1＞Re-9＞秀-T（CK），Re-5 生長最快，滿瓶時間比出發菌株早6 d；栽培種菌絲平均長速依次為：Re-6＞Re-5＞Re-2＞Re-9＞Re-1＞秀-T（CK），且Re-2、Re-5與Re-6 之間差異不顯著，Re-2 與Re-5 生長最快，菌絲滿袋時間比出發菌株早10.5 d。

表1 異核體分離株的菌絲生物學特性

圖2 出發菌株與復壯菌株擴繁種生長情況

表2 出發菌株與復壯菌株擴繁種菌絲生長情況

2.2.2 再生菌株栽培結果

由圖3、表3可知，經再生復壯后的菌株現原基、子實體形成、第1 潮菇采收時間均比出發菌株早。并且再生復壯后的菌株子實體分化快，出菇時間集中，出菇整齊，產量均有所提高。生物學效率由高到低依次為Re-2＞Re-5＞Re-9＞Re-6＞Re-1＞秀-T（CK），其中Re-2 生物學效率最高，為62.17%，增產27.90%。

圖3 出發菌株與復壯菌株子實體栽培出菇情況

表3 出發菌株與復壯菌株栽培結果

2.3 原生質體再生菌株胞外酶活性

秀珍菇為一種木腐菌，能夠分泌一系列的胞外酶降解木質纖維素，這些酶能夠通過協同作用將外界的木質纖維素降解成小分子的物質以供自身的利用[13]。結果表明（表4），復壯后的菌株羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶活性均高于出發菌株。復壯后菌株羧甲基纖維素酶活性由高到低依次為Re-2＞Re-9＞Re-5＞Re-6＞Re-1＞秀-T（CK）；木聚糖酶活性由高到低依次為Re-2＞Re-9＞Re-5＞Re-6＞Re-1＞秀-T（CK）；漆酶活性由高到低依次為Re-2＞Re-9＞Re-6＞Re-5＞Re-1＞秀-T（CK）。

表4 出發菌株與復壯菌株胞外酶酶活

3 小結與討論

在食用菌的菌種復壯中，采用的方法主要有挑取菌絲尖端法、組織分離法、原生質體再生法等。其中，挑取菌絲尖端法操作簡易、技術難度較低，但往往要挑取多次，周期較長，且經出菇驗證其復壯效果并不理想。組織分離法需用退化菌株的子實體分離，栽培出菇周期較長，而且一旦菌株退化嚴重或不出菇影響組織分離。原生質體再生法的缺點是技術要求相對較高，優點是復壯效果好，復壯周期短，減少了后續試驗的工作量。

近年來，原生質體再生法在其他食用菌如平菇[14]、茯苓[15]復壯中都取得良好效果。樊曉琳等[4]采用灰色系統關聯度分析法將不同方法得到的提純復壯雙孢蘑菇菌株與出發菌株相比較，得出原生質體再生法的提純復壯效果最好。伍虹蓉[16]利用原生質體再生法得到毛木耳復壯菌株，并且證明其干耳產量同CMC 酶、木聚糖酶活性呈正相關。由此可見，原生質體再生技術已被廣泛應用于食用菌菌種復壯，但對秀珍菇鮮有報道。

秦俊哲等研究表明，纖維素酶活性高低可以反映菌株活性的強弱[17]，聶榮榮等[18]將漆酶作為金針菇液體菌種活力檢測的生物標記物。Ivana Eichlerová 等[19]在研究不同低溫存儲方式對糙皮側耳菌種影響時，也是以漆酶作為主要參考指標。試驗通過原生質體再生法復壯秀珍菇，得到的再生菌株在平板培養基中菌絲恢復到退化前的長勢強、菌絲健壯、菌落邊緣整齊的菌絲狀態；復壯后菌株菌絲胞外酶活性有所提高；出菇試驗中，菇蕾分化及出菇時間提前，生物學效率提高。其中Re-2各方面指標較為理想，可逐步推廣。另外，退化的秀珍菇菌株秀-T 的菌絲菌落不規則，存在角變，與缺乏氮源菌絲菌落形態相似[20]。筆者推測秀珍菇秀-T 的退化表現之一為營養元素特別是氮素的吸收不良。由此可見，針對退化秀珍菇的復壯方法，除了原生質體再生法，是否可以通過調節母種或栽培料中配方配比來達到復壯效果（這種復壯方法已有復壯杏鮑菇、草菇報道[7，21]），還有待進一步研究。