響應面法優化羊肚菌液體發酵營養條件

趙航軻 陳 杭 馬 薇 羊玉蓉 降初拉爾布 唐 瑤 唐明先

（甘孜州農業科學研究所，四川康定 626000）

羊肚菌（Morchella）隸屬于子囊菌亞門（Ascomycota）、盤菌綱（Discomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬[1-3]，是世界四大珍貴食用菌之一。羊肚菌富含多種氨基酸[4]，除色氨酸外，其余必需氨基酸含量均比面包、牛奶、牛肉等的含量高，還含有39.7%的碳水化合物及24.5%的蛋白質，具有很高的營養價值[5]。此外，研究發現羊肚菌多糖和蛋白質[6]具有抗腫瘤、免疫調節、抗氧化和降低膽固醇等生物活性[7]，對抗腫瘤藥物的研究與開發具有重要意義。

隨著食用菌產業的發展，菌種的生產要求越來越高，而食用菌液體菌種具有制種周期短、成本低、易操作、純度高、菌齡一致等優勢，在金針菇、黑木耳、杏鮑菇等食用菌生產中廣泛應用[8]。目前有關羊肚菌液體菌種研究較少。筆者在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken 響應面法對羊肚菌液體發酵營養條件進行優化，以期為羊肚菌液體菌種制備及菌絲深層發酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試羊肚菌菌株：六妹羊肚菌（Morchellasextelata）。（2）基礎培養基：葡萄糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO41 g，VB110 mg，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

將保藏的羊肚菌菌種接種于平板培養基上，置于24 ℃恒溫培養箱培養7 d。

1.2.2 羊肚菌液體菌種培養基組分的優化

碳源篩選：取活化后羊肚菌菌塊0.5 cm2，分別接種至用玉米粉、可溶性淀粉、玉米芯粉、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇替代葡萄糖的液體培養基中，其余組分與基礎培養基相同。250 mL 三角瓶，裝液量為150 mL，pH 自然，置24 ℃、130 r/min 恒溫搖床，培養7 d。菌絲體用蒸餾水清洗，置55 ℃干燥箱中烘至恒重，稱量菌絲體干重，確定最適碳源，并進一步篩選出其最適質量濃度。試驗設置5個平行。

氮源篩選：分別取活化后羊肚菌菌塊0.5 cm2，接種至用硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨、蛋白胨、黃豆粉、尿素、硝酸鈣替代酵母粉的液體培養基中，其他操作同碳源試驗。

無機鹽篩選：分別取活化后羊肚菌菌塊0.5 cm2，接入用MnSO4、KH2PO4、FeSO4、CaCl2、NaCl、K2PO4、K2HPO4、K2SO4替代K2HPO4的液體培養基中，其他操作同碳源試驗。

生長因子篩選：分別取活化羊肚菌菌塊0.5 cm2，接入用VB2、VB6、VBH、吲哚乙酸、葉酸、煙酸、赤霉素替代VB1的基礎培養基中，其他操作同碳源試驗。

液體培養營養條件響應面法優化：如表1所示，在上述單因素試驗基礎上，分別選取碳源（X1）、氮源（X2）、無機鹽（X3）、生長因子（X4）4 個因素為考察對象，以菌絲體干重（Y1）為響應值，采用響應面分析法確定羊肚菌液體培養最佳營養條件。

表1 羊肚菌液體培養基4因素3水平試驗設計

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

（1）碳源：由圖1a、b 可知，8 種供試碳源中以玉米粉為唯一碳源時，羊肚菌菌絲體干重最高（P＜0.05），為4.77 g/L，所以確定玉米粉為試驗最適碳源，最適質量濃度為20 g/L。

（2）氮源：由圖2a、b 可知，8 種供試氮源中以黃豆粉為唯一氮源時，羊肚菌菌絲體干重最高（P＜0.05），為5.95 g/L，所以確定黃豆粉為試驗最適氮源，最適質量濃度為5 g/L。

（3）無機鹽：如圖3a、b 所示，8 種供試無機鹽中以KH2PO4為唯一無機鹽時，菌絲體干重最高（P＜0.05），為6.94 g/L，所以確定KH2PO4為最適無機鹽，最適質量濃度為1.5 g/L。

（4）生長因子：如圖4a、b 所示，7 種供試生長因子中以VB6為唯一生長因子時，菌絲體干重最高（P＜0.05），為8.65 g/L，所以確定VB6為最適生長因子，最適質量濃度為10 mg/L。

圖1 供試碳源（a）及最適碳源質量濃度梯度篩選結果（b）

圖2 供試氮源（a）及最適氮源質量濃度梯度篩選結果（b）

圖3 供試無機鹽（a）及最適無機鹽質量濃度梯度篩選結果（b）

2.2 響應面優化試驗結果

試驗結果見表2。

圖4 供試生長因子（a）及最適生長因子質量濃度梯度篩選結果（b）

以X1、X2、X3和X4為響應變量，以Y1值為響應值對表2 數據進行處理，方差分析（表3），模型P值＜0.001，因此該模型有意義且達到最顯著水平。X1、X2、X3、X4、X1X2、X12、X22、X32、X42項差異極顯著，X1X3、X2X3差異顯著，X1X4、X2X4、X3X4差異不顯著。復相關系數R2＝0.9674，表明相關性好，失擬值P值0.1348＞0.05，實驗可信。經Design-Expert 8.0.6軟件分析得到預測模型為：

Y1=+11.25+0.53X1+0.62X2+0.25X3+0.70X4-0.46X1X2-0.37X1X3-0.081X1X4+0.31X2X3+0.17X2X4-0.27X3X4-0.93X12-0.95X22-0.93X32-0.99X42

利用回歸方程分析羊肚菌菌絲體干重隨各因素變化的響應曲面圖。由響應曲面圖可知玉米粉、黃豆粉、KH2PO4、VB6各因素對菌絲體干重的影響。每個響應面代表2 個獨立因素之間的交互作用，另一個因素保持在0水平編碼。

玉米粉質量濃度與黃豆粉質量濃度兩因素的交互作用極顯著：在玉米粉質量濃度較高時，隨著黃豆粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重迅速上升至平穩，隨后略有下降；在黃豆粉質量濃度較高時，隨著玉米粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重迅速上升至平穩，隨后略有下降；在玉米粉質量濃度較低時，隨著黃豆粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重緩慢上升至平穩，隨后穩步下降；在黃豆粉質量濃度較低時，隨著玉米粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重緩慢上升至平穩，隨后穩步下降（圖5）。

表2 響應面試驗設計因素水平及結果

表3 響應面試驗方差分析

圖5 玉米粉質量濃度與黃豆粉質量濃度兩因素的交互作用

黃豆粉質量濃度與KH2PO4質量濃度兩因素的交互作用顯著：在KH2PO4質量濃度較高時，隨著黃豆粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重迅速上升至平穩，隨后下降；在KH2PO4質量濃度較低時，隨著黃豆粉質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重緩慢上升至平穩，隨后下降；在黃豆粉質量濃度較高時，隨著KH2PO4質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重迅速上升，隨后略有下降；在黃豆粉質量濃度較低時，隨著KH2PO4質量濃度的上升，羊肚菌菌絲體干重緩慢上升至平穩，隨后穩步下降（圖6）。

玉米粉質量濃度與KH2PO4質量濃度兩因素的交互作用顯著：在KH2PO4質量濃度較高時，隨著玉米粉質量濃度的上升，菌絲體干重迅速上升至平穩，隨后略有下降；在KH2PO4質量濃度較低時，隨著玉米粉質量濃度的上升，菌絲體干重緩慢上升至平穩，隨后穩步下降；在玉米粉質量濃度較高時，隨著KH2PO4質量濃度的上升，菌絲體干重迅速上升至平穩，隨后略有下降；在玉米粉質量濃度較低時，隨著KH2PO4質量濃度的上升，菌絲體干重緩慢上升至平穩，隨后穩步下降（圖7）。

圖6 黃豆粉質量濃度與KH2PO4質量濃度兩因素的交互作用

圖7 玉米粉質量濃度與KH2PO4質量濃度兩因素的交互作用

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，影響羊肚菌菌絲體干重的各因素最優值為玉米粉20.33 g/L，黃豆粉5.34 g/L，KH2PO41.53 g/L，VB610.73 mg/L，此營養條件培養羊肚菌菌絲體干重（理論）達11.54 g/L。

驗證試驗：為檢驗培養基優化工藝的可信度，結合實際試驗操作的可行性，采用最優營養條件組合進行5 次驗證試驗，得羊肚菌菌絲體干重為（11.35±0.21）g/L，相對誤差為1.62%，該結果確定采用響應面法優化羊肚菌液體培養最佳營養條件是有效可行的。

3 小結

羊肚菌液體發酵周期短，污染率低，生產成本低。季向陽等通過正交試驗確定羊肚菌最佳液體培養條件，優化后菌絲體干重最高為9.18 g/L[9]。筆者采用單因素試驗結合響應面法對羊肚菌液體培養基進行優化，優化獲得的羊肚菌液體培養基培養的菌絲球均勻致密，驗證試驗得出菌絲體干重為11.35 g/L，與文獻報道相比提高了23.64%。研究結果為羊肚菌深層發酵、液體菌種制備及人工栽培提供數據積累和試驗參考。