發酵豆制品中白點防治的研究進展

張錦航，鐘 武，郭 小，李二虎*

（華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

發酵豆制品是以大豆為主要原料，經微生物發酵，再經調配而制成的一類大豆食品[1]。腐乳、豆豉、豆醬和醬油歷史悠久，被列為我國四大傳統發酵豆制品，深受廣大消費者的喜愛[2]。近年來，發酵豆制品因其具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血壓、降血脂等生理功能而備受矚目[3-5]。在實際生產中，成熟的腐乳、豆豉和豆醬產品經常會出現白點，嚴重影響成品的外觀和質量，而有白點的產品會極大降低消費者的購買欲，消費者往往會拒絕購買有白點的產品，因而給企業造成很大的經濟損失[6]。有許多學者針對發酵豆制品中白點問題做了大量研究并取得一定進展，本文從前發酵工藝和后發酵工藝著手，對發酵豆制品中白點防治的方法做了一些綜述和探討，旨在促進深入解決發酵豆制品中的白點問題，并為發酵豆制品的廣泛應用及深度開發提供參考。

1 白點構成及形成機理

發酵豆制品中的白點是指在腐乳、豆醬、豆豉等豆制產品成熟后，其表面出現直徑為1 mm左右的乳白色硬圓粒狀小點或白斑，也有部分會懸浮在醬料汁液中或沉積于容器底部[7]。最初有人推測這些白點可能是草酸鈣結晶或是酪氨酸的金屬鹽，后經一系列研究表明白點是以酪氨酸為主的過飽和氨基酸結晶。如今有研究進一步發現，白點主要是由游離酪氨酸、游離苯丙氨酸以及富含酪氨酸和苯丙氨酸的短肽組成[8]。豆制品在前發酵過程中，接種的毛霉和米曲霉產生蛋白酶，水解蛋白質生成各種游離氨基酸和短肽，從而形成發酵豆制品獨特的風味。蛋白水解主要分為兩步，首先以內肽酶為主從肽鏈內部切斷肽鍵將大豆蛋白分解成可溶性短肽，其中包括以酪氨酸為末端的肽鏈，然后在外切蛋白酶（主要是羧肽酶）水解下形成游離氨基酸[9]。有研究表明[10-12]，毛霉蛋白酶在降解大豆分離蛋白時，由于其酶切位點特性，更傾向于將酪氨酸水解到可溶性肽中，還發現大豆蛋白的苦味與短肽鏈末端的酪氨酸和苯丙氨酸的數量有關，而羧肽酶能對其水解并有脫苦作用，這些結果表明，大豆蛋白在內外肽酶的共同作用下會優先釋放出酪氨酸。此外，制曲時間越長，羧肽酶聚集越多，且后期加入的食鹽作為電解質能促進蛋白酶的釋放，從而產生過量酪氨酸。酪氨酸溶解度很低，在水中僅為450 mg/L（20 ℃），很容易析出結晶，腐乳中酪氨酸含量超過2 mg/g便會形成白點[13]。白點最初是以微小晶核的形式出現，隨著溶液中酪氨酸濃度增大，晶核逐漸變大直至形成白點[14]。

2 白點防治的方法

外觀上，白點的存在引起消費者對產品安全性的質疑；口感上，酪氨酸和苯丙氨酸作為白點的主要成分會帶來苦味和顆粒感，最終影響產品的生產和銷售[15]。控制白點本質上是減少酪氨酸的生成，或增加酪氨酸的溶解度。基于此，從發酵工藝條件和原料等方面著手，展開了很多防治白點的研究。

2.1 前發酵工藝

2.1.1 培菌條件

有研究結果表明[16-17]，白點的形成與毛霉的培養條件密切相關，通過控制前期發酵時間、發酵溫度、pH值及相對濕度等因素，選擇適宜毛霉的生長條件能有效抑制白點的生成，其原理主要是通過限制酶的活性來減少酪氨酸生成。培菌溫度過低，不利于菌絲生長，進而阻礙蛋白酶的合成；培菌溫度過高，菌絲生長太快則水分流失也越快，易促使蛋白酶的衰退老化[18]。培菌時間過長，蛋白酶系積累越多，酶活也越高，大豆蛋白消化程度越大，最終導致酪氨酸的析出量越大，白點出現的越快，且產品最終的形態很難穩定，極容易被破壞；培菌時間太短，兒茶酚氧化酶和蛋白酶系活力不高，雖能降低白點率，但會直接影響到產品最終的質量，色澤芳香和滋味達不到要求[19]。此外，培菌房的相對濕度、培菌時的pH值等都會影響蛋白酶活性[20]。

有研究發現，腐乳前期發酵時溫度控制在26～28 ℃，室內相對濕度90%以上，前酵時間控制在45 h左右，成品白點率比常規條件生產腐乳的白點率降低94%[16]。氨基酸態氮是判斷發酵是否成熟的重要指標，閔世豪等[8]通過模擬豆醬發酵中酪氨酸及氨基酸態氮的含量變化發現，豆醬模擬發酵體系中酪氨酸的積累與蛋白分解程度密切相關，溫度是影響酪氨酸含量及蛋白分解程度最重要的因素，在30 ℃、100 g/L鹽含量條件下進行發酵，可以保證較高的蛋白質分解程度，并減少了發酵產品中的酪氨酸含量。因此，找到培菌條件的最適平衡值對后續產品中白點的防治至關重要。

2.1.2 菌種選育

選育優良菌株可以提高目標產物的產量和品質，在一定程度上改變產品組分，優化工藝條件，開發出更具特色的產品[21-22]。在發酵豆制品中通常選用菌種馴化來優化菌株，馴化一般是指通過人工措施使微生物逐步適應某一條件，從而實現定向選育微生物的一種方法[23]。通過馴化可以獲得具有較高耐受力及活動能力的菌株，其原理主要是通過激活或抑制微生物中某種酶的活性，從而達到控制該酶產代謝產物速率的目的，當向培養基中加入益于微生物生長的營養物質時，微生物生長旺盛，酶的代謝速率相應加快；當向培養基中加入某種酶的代謝產物時，依據酶生物合成產物的阻遏機理，該酶的活性受到抑制，其代謝速率相應降低[23]。基于此，可在培養基中加入一定的酪氨酸以抑制肽酰酪氨酸水解酶的活性，進而降低其產酪氨酸的能力，當菌株長期處于酪氨酸的生長環境時，逐漸淘汰不適應的菌株，適者通過表型適應逐漸演變成進化性適應，逐代升級，最終得到低肽酰酪氨酸水解酶活的菌株，達到馴化目的[24]。

林影等[13]通過對滬釀3.042米曲霉進行馴化，發現經16代馴化的米曲霉菌株制得的豆豉，其酪氨酸含量大大減少而總氨基酸量基本不變，抑制白點生成的同時提高了產品鮮味；而在研究蠶豆醬時，查文龍等[25-26]也對3.042米曲霉進行馴化，前者發現經15代馴化的菌株生產的蠶豆辣醬，5個月發酵后基本上沒有出現白點；后者則是篩選出了能穩定產生少量中性蛋白酶和酸性蛋白酶的米曲霉菌株，能有效避免豆醬中產生酪氨酸結晶，保證了產品品質。鄭立紅等[27]對日本豆醬專用曲進行分離純化，選育出一株性能良好的米曲霉（編號FNR-01），能有效控制白點生成。江景泉[24]對五通橋毛霉（Mucor wutungkiao）和雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）進行馴化，發現五通橋毛霉馴化至15代時的相對蛋白酶活力下降到89.49%，對酪蛋白的水解率下降到74.91%；雅致放射毛霉馴化至13代時的相對蛋白酶活力下降到90.24%，對酪蛋白的水解率下降到72.23%，同時觀察發現，腐乳在180 d貨架期內，馴化菌種發酵樣的白點率遠低于普通對照樣。因為發酵過程需要一定的蛋白酶活力，若蛋白酶活力太低，則蛋白分解緩慢，從而延長了發酵周期，因而，對菌株進行15代左右的馴化能有效減少酪氨酸的生成[28]。

2.2 后發酵工藝

2.2.1 含鹽量及酒精度

豆制品在后酵工藝中大都會進行腌制，加鹽可以析出水分，并且在后續制作過程中不會使產品過早酥爛。不僅如此，高濃度鹽還抑制了大部分微生物的生長，避免產品腐敗變質，同時也大大降低了產酪氨酸、苯丙氨酸的蛋白酶活，因而適當提高鹽濃度可以抑制白點的生成[28]。何熙[29]在研究腐乳時發現減小腌制時的用鹽量以及減小泡乳鹽水濃度都會增加腐乳白點率，可能是在相對較低的鹽濃度下，產酪氨酸的酶系活性較高，促進了酪氨酸的生成，進而增加了白點率。雷宏杰[28]研究證實，鹽水濃度為21%的豆醬發酵中，酪氨酸和苯丙氨酸含量相比正常發酵（鹽水濃度18%），分別降低了約26%和20%。

在腐乳的加工過程中，后酵湯料對腐乳的品質和安全起到了重要的作用，其中的乙醇既能增進產品的風味，又可以和鹽協同作用防止腐敗變質，同時也在一定程度上抑制了羧肽酶活性，水溶性蛋白質的降解受到限制[30-31]。哈爾樂哈西·布勒斯別克等[32]制作了不同酒精度數的腐乳，后期發酵六個月，隨著發酵時間的延長，腐乳中白點數量逐漸增多，酒精度為18%vol和12%vol的腐乳先出現白點，而酒精度為13%vol的腐乳白點出現時間最晩，可能是當酒精度處在一個合適的范圍內時可以有效減緩白點生成的速度。朱洪康[17]研究了含鹽量及酒精度對腐乳湯汁中毛霉羧肽酶活性的影響，當酒精含量＜5%時，羧肽酶酶活基本不變，＞6%時酶活會逐漸降低；鹽濃度介于7.0%～7.5%間酶活略有升高，超過7.5%時酶活則逐漸下降。由此可見，合理調控后酵條件中的含鹽量及酒精度，可以有效減少白點生成。

2.2.2 調酸發酵

酪氨酸等電點為5.66，在pH＜5.66的溶液中，酸性條件降低了蛋白酶的活力，從而抑制酪氨酸的產生[17]。CHIOU R Y Y等[33]研究了幾種微生物生長抑制劑對白點形成的影響，以米曲和米-豆曲作為酶源制作腐乳，并分別加入微生物生長抑制劑對羥基苯甲酸酯、磺胺、四環素、氯霉素和冰醋酸，發酵一年后，發現以米曲作酶源的產品中未出現白點，以米-豆曲作為酶源并在鹽溶液中加入10 mL/L冰醋酸的產品也未出現白點。成分分析結果表明，米曲為酶源的腐乳鹽溶液的pH、酪氨酸含量以及氨態氮總量均低于米-豆曲為酶源的腐乳鹽溶液。由此推論，酸性條件可抑制腐乳白點的形成。

2.2.3 添加劑

凡是溶于水能夠顯著降低水的表面能的物質稱為表面活性劑，由于表面活性劑分子一端為親水的極性基團，另一端為親油的非極性基團，具有獨特的兩親性，因而在溶液體系中加入表面活性劑能降低表面張力并增強界面的增溶作用[34]。由于一般氨基酸尤其是酪氨酸在常溫下溶解度很小，更容易析出，表面活性劑的添加使其不易集結，更多的分散或溶解于溶液中，從而達到減少白點生成的目的[35]。李國基等[36]在研制豆豉醬料時加入0.2%的三種表面活性劑苯乙烯化苯酚（styrenated phenol，SP）、淀粉脂肪酸酯（fatty acid ester of starch，SFE）和蔗糖脂肪酸酯（sucrose esters，SE），觀察成熟產品，發現表面白點已明顯減少或不再出現，其效果：SFE＞SP＞SE。朱洪康[17]在成熟腐乳湯汁中加入適量的吐溫-80，結果發現添加吐溫-80的腐乳中的白點比沒有添加的減少了50%，這說明表面活性劑能顯著改善溶液性質，增加酪氨酸溶解度，降低白點生成率。

雷宏杰[28]研究了抑菌劑對氨基酸含量的影響，在豆醬中分別加入定量的山梨酸鉀、苯甲酸鈉和冰乙酸，結果發現成品醬中酪氨酸含量、苯丙氨酸、呈味氨基酸的含量均有明顯降低，其中冰乙酸降低酪氨酸含量的效果比山梨酸鉀和苯甲酸鈉更好。因此在豆醬發酵過程中，可以考慮加入適量冰乙酸來抑制微生物的生長，降低酪氨酸的含量。

YANG J等[37]研究表明，在含有白點的腐乳中加入淀粉液化芽孢桿菌的谷氨酰胺酶，谷氨酰胺為供體，白點中的酪氨酸和苯丙氨酸作為受體，在谷氨酰胺酶催化下合成了兩種含γ-谷氨酰肽的受體氨基酸。該研究發現，腐乳中60.57%的白點轉化為γ-谷氨酰肽，其中酪氨酸和苯丙氨酸的消耗分別為68.5%和70.89%；并且由于合成物中短鏈γ-谷氨酰肽的存在，產品風味得以提高。這種方法為解決腐乳中白點問題提供了一種新的途徑。此外，哈爾樂哈西·布勒斯別克等[32]發現在腐乳后酵中加入大豆異黃酮抗氧化劑也能抑制白點的產生，其原理還有待進一步研究。

2.2.4 熱處理

毛霉蛋白酶的化學本質是蛋白質，由于蛋白質的不可逆性，有些腐乳研究利用高溫加熱鈍化酶的活性，甚至使酶完全失活，降低蛋白質過度水解成小分子肽的可能。酶的底物減少，從而游離酪氨酸生成量降低。江景泉[24]將準備后酵的腐乳揭蓋后加熱蒸煮，再重新密封貯存2個月后觀察發現，蒸煮5 min或以上時間的腐乳幾乎沒有白點產生，但腐乳也失去了特有風味，產品質量得不到保障。朱洪康[17]將毛霉蛋白酶在80 ℃保溫15 min，蛋白酶基本失活，將成熟腐乳在此條件下進行加熱鈍化處理，發現熱處理后的腐乳白點生成率降低了8.3%。因此，對成熟腐乳進行適當的熱處理，找到合適的處理條件可以降低白點生成率。

然而，傳統加熱耗時長，只能由外向內進行熱量傳輸。近年來，微波技術因其時間短、效率高、操作簡易等優勢已廣泛應用于食品加工中。其滅酶殺菌的原理，主要是利用微波的熱效應、非熱致死效應和電磁波的協振效應，在短時間內使酶失活，微生物則因體內活性蛋白質變性而死亡，從而達到滅酶滅菌目的[38]。江景泉[24]將成熟腐乳置于400 W功率的微波下進行不同時間段的處理，貯存2個月后分析理化指標發現，在120 s或更久微波處理后的腐乳樣品中，酪氨酸、氨基酸態氮、水溶性蛋白質等含量無明顯增加，說明微波能較好的抑制白點產生并改善產品外觀品質。

2.3 基因工程

謝顯華等[39]運用基因工程手段將產白點腐乳和正常腐乳的微生物基因進行對比測序，發現了與酪氨酸結晶可能有關的微生物，初步推測腐乳中白點生成與紅色鏈孢霉、蠟樣芽胞桿菌及蘇蕓金芽胞桿菌的缺失有關，這為后續研究提供了方向。紀海兵等[40]從腐乳中分離鑒定出一種發酵菌株，命名為雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）PEP001，并從該毛霉發酵液中檢測到可釋放多肽C末端酪氨酸的羧肽酶活性，推測是羧肽酶Y（carboxypeptidase Y，CPY）。經酶學性質分析顯示，CPY在腐乳后發酵環境中有較高酶活，它可能在腐乳白點形成過程起著關鍵作用。通過敲除雅致放射毛霉中編碼CPY的基因，研究基因敲除菌的生長代謝情況，并用該菌進行發酵生產，可能會從根本上解決白點問題。

2.4 其他方法

林振佳[41]從成熟后沒有產生白點的腐乳中分離出微生物進行培養，將培養好的微生物按10%接種量配制成鹵水，罐裝于腐乳胚瓶發酵3個月，觀察發現沒有白點產生，再用此無白點產生的腐乳鹵汁以10%比例配制新鹵水，灌裝入新腐乳胚瓶后發酵3個月，發現白點出現率也只有2%。究其原因可能是腐乳鹵汁中所含有的不產白點的微生物數量占優勢，抑制了產白點微生物的生長繁殖，從而減少了腐乳白點生成。

傳統豆醬以黃豆和面粉為主要原料，在發酵過程中產生白色顆粒狀物質，這是由于制曲過程中米曲霉無法分泌足夠的蛋白酶和淀粉酶，導致面粉中的蛋白質未完全分解而與醬料中的游離氨基酸聚合形成在豆醬表面和瓶壁上。耿予歡等[42]發現這種白色物質的主要成分為酪氨酸和面筋蛋白，通過增加前期翻醬次數，翻醬均勻、徹底使結團料粉分散可以有效減少白色物質生成。肖霄等[43]在研究豆醬時發現，通過常壓蒸煮制曲40 h的豆醬與進行高壓蒸煮制曲40 h的豆醬在發酵第5天的時候均有白點出現，但后者產白點數量相對較少。分析認為，豆醬中白點的產生與原料的蒸煮條件和制曲時間沒有直接關系，但白點產生的時間和數量有所不同，可能與氨基酸分解速度有關，高壓蒸煮能有效減少白點生成。

3 結語

傳統發酵豆制品在國內已有上千年歷史，近年來隨著其營養功能的不斷發掘，發酵豆制品在人們膳食結構中占據愈加重要的地位。雖然豐富的氨基酸賦予了產品獨特的風味和營養價值，但隨之也帶來了過飽和氨基酸結晶的問題，這始終制約著發酵豆制品的發展。為此，廣大科研工作者做出了很多努力，如改良菌株、優化工藝等，雖然這些方法確實能有效減少白點生成，但由于錯綜復雜的微生物參與整個發酵過程，使得實際工作困難重重，很難追根朔源找到徹底解決白點的辦法。未來對發酵豆制品的研究應側重于應用現代分子生物學技術，通過聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳、腸桿菌基因間重復一致序列-聚合酶鏈反應等手段與傳統培養方法相結合，全面了解白點與微生物組成的具體關系，尋找能根除白點的有效方法；其次，還可以研究白點向有益成分進行轉化，開發具有特定功能、安全健康的新型食品。盡早解決白點問題，不僅能使具有民族特色的發酵食品市場前景更加廣闊，還能進一步弘揚我國傳統文化，為世界人民造福。