玉米粉液化及糖化工藝條件優(yōu)化

孫銘澤，宋遙遙，盧曉霆*

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012）

玉米作為主要的糧食作物，一直以來(lái)是商品市場(chǎng)上的大品種，玉米深加工產(chǎn)品主要有玉米淀粉、玉米蛋白粉、變性淀粉、玉米淀粉糖、玉米油、食用酒精、谷氨酸、賴氨酸、木糖醇等數(shù)百個(gè)品種[1]。微生物油脂也可采用玉米淀粉糖發(fā)酵生產(chǎn)[2]，具有潛在商業(yè)化價(jià)值，可應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)保健品、藥物、水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料和生物柴油原料等方面[3-8]。但目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)淀粉糖的原料大都采用玉米淀粉，生產(chǎn)成本高，作為發(fā)酵用糖液會(huì)造成資源浪費(fèi)[9]。與復(fù)雜的濕法玉米淀粉生產(chǎn)技術(shù)相比，玉米粉是將玉米籽粒通過(guò)磨碎、篩分、風(fēng)選等簡(jiǎn)單方法，分出胚芽和纖維，而得到低脂肪的玉米粉。玉米粉水解糖液含有葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂肪及多種維生素、礦物質(zhì)和微量元素等，是發(fā)酵工業(yè)物美價(jià)廉的重要原料[10-11]。玉米粉液化、糖化工藝優(yōu)化的方法有雙酶法、復(fù)合糖化酶法、噴射液化法、擠壓酶解法等[12-15]，目的是提高液化液質(zhì)量，為糖化創(chuàng)造有利條件，縮短糖化時(shí)間，提高糖液質(zhì)量，節(jié)約能耗，降低生產(chǎn)成本。

本研究以玉米粉為原料，以葡萄糖當(dāng)量（dextrose equivalent，DE）值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)對(duì)玉米粉水解糖液液化、糖化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為微生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉（水分含量為13.85%，粗淀粉含量為71.10%）：市售；α-淀粉酶（酶活4 000 U/g）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；糖化酶（酶活100 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水氯化鈣（分析純）：西隴化工股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；丙三醇、葡萄糖（均為分析純）：北京化工廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BGT-8A糖化儀：杭州博日科技有限公司；GT10-1型高速臺(tái)式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；UV5100B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；LH-T55數(shù)顯折光儀：杭州陸恒生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米糖液制備工藝流程

1.3.2 分析方法

（1）還原糖的測(cè)定

采用DNS法[16]，待測(cè)液5 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋至適宜倍數(shù)待測(cè)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，取配制好的不同含量得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.5 mL，再加入3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑1.5 mL，輕搖混勻，沸水浴5 min顯色，冷卻后加4 mL去離子水，振蕩均勻。在波長(zhǎng)540 nm處比色，以去離子水為空白，測(cè)出各管的吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.000 7x+0.021 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 1。取適當(dāng)稀釋后的樣品0.5 mL，按上述方法測(cè)吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算待測(cè)液還原糖含量。

（2）干物質(zhì)含量的測(cè)定

采用折光法[17]測(cè)定料液的干物質(zhì)含量（°Bx）。

（3）葡萄糖當(dāng)量值

DE值計(jì)算公式如下[18]：

1.3.3 玉米粉糖液液化工藝優(yōu)化

液化液的DE值控制一般在15%～20%[19-20]。液化DE值過(guò)低，料液易老化、黏度較高、不宜操作，還會(huì)將一些液化不完全的大分子糊精帶入糖化過(guò)程，直接影響糖化質(zhì)量；液化程度過(guò)高不利于糖化過(guò)程酶與底物形成絡(luò)合結(jié)構(gòu)，影響催化效率。

單因素試驗(yàn)：以玉米粉為原料，按料液比分別為1∶8、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2（g∶mL）配制不同濃度的粉漿，pH值為6.2，無(wú)水氯化鈣含量0.2%，α-淀粉酶添加量分別為2 U/g、4 U/g、6 U/g、8 U/g、10 U/g玉米粉，液化溫度分別為70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃，液化時(shí)間分別為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，酶解結(jié)束沸水浴10 min滅酶，5 000 r/min離心取上清液，測(cè)定還原糖含量與干物質(zhì)含量，計(jì)算DE值。分別考察料液比、α-淀粉酶添加量、液化溫度及液化時(shí)間對(duì)玉米粉糖液液化的影響。

正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，使用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以DE值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)確定最優(yōu)液化工藝條件。

1.3.4 玉米粉糖液糖化工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：液化液調(diào)pH值為4.3，糖化溫度分別為50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃，糖化酶添加量分別為50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g、300 U/g，糖化時(shí)間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h，糖化液沸水浴10 min滅酶，5 000 r/min離心取上清液，測(cè)定還原糖含量與干物質(zhì)含量，計(jì)算DE值。糖化酶添加量、糖化溫度及糖化時(shí)間對(duì)玉米粉糖液糖化的影響。

正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，使用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以DE值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)確定最優(yōu)糖化工藝條件。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

本研究測(cè)定試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果為平均值的方式表示。使用OEA3.1軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，SAS 9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米粉糖液最佳液化工藝條件的確定

2.1.1 料液比對(duì)液化效果的影響

由圖1可知，隨著玉米粉漿中含水量的降低，DE值先逐漸增加后又降低，料液比為1∶4（g∶mL）時(shí)DE值最大；料液比過(guò)小即料液濃度過(guò)低，淀粉水解產(chǎn)物糊精濃度低使酶活力穩(wěn)定性降低[17]，料液中還原糖產(chǎn)生的少，DE值較低；料液比過(guò)大即料液濃度過(guò)高，理論上可產(chǎn)生較多的糊精對(duì)增加酶活力穩(wěn)定性有提高作用，但料液含水量過(guò)低，原料玉米粉吸水不充分，流動(dòng)性較差，黏度較高，不利于酶與底物結(jié)合，故產(chǎn)生的還原糖較少，造成料液DE值較低[21-22]。因此，最適料液比為1∶4（g∶mL），此時(shí)料液淀粉水解產(chǎn)物糊精濃度可使酶活力穩(wěn)定性增加，同時(shí)有利于酶與底物結(jié)合，產(chǎn)生短鏈糊精和少量低分子糖類(lèi)，從而還原糖增加、DE值最大。

圖1 料液比對(duì)葡萄糖當(dāng)量值的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on dextrose equivalent value

2.1.2 液化時(shí)間對(duì)液化效果的影響

液化開(kāi)始時(shí)首先是α-淀粉酶分解淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵產(chǎn)生糊精和低聚糖，此酶促反應(yīng)速度較快。但α-淀粉酶不能水解α-1,6糖苷鍵，也不能水解緊靠分支點(diǎn)的α-1,4糖苷鍵，所以水解支鏈淀粉的速度較直鏈淀粉慢。此時(shí)酶解產(chǎn)物的積累與α-1,6糖苷鍵相對(duì)比例的增大會(huì)使得酶促反應(yīng)速度下降[23]。由圖2可知，液化時(shí)間為40 min時(shí)，DE值達(dá)到一個(gè)高點(diǎn)，其原因是最初還原糖含量的增加速度比干物質(zhì)含量增加的速度要快，但是此時(shí)的還原糖含量卻沒(méi)有達(dá)到最大值。而當(dāng)液化時(shí)間為60 min時(shí)，DE值稍有降低，是因?yàn)檫€原糖的含量平穩(wěn)，干物質(zhì)量略有升高[18]。之后隨著時(shí)間增加DE值逐漸升高。考慮液化醪DE值在15%～20%對(duì)后序糖化有利，因此，選擇最適液化時(shí)間為60 min。

圖2 液化時(shí)間對(duì)葡萄糖當(dāng)量值的影響Fig.2 Effect of liquefaction time on dextrose equivalent value

2.1.3α-淀粉酶添加量對(duì)液化效果的影響

在酶促反應(yīng)中，底物濃度足夠高時(shí)，酶促反應(yīng)速度隨著酶添加量的增加而提高。由圖3可知，隨著α-淀粉酶添加量的增大，液化醪DE值逐漸提高。當(dāng)液化醪液化程度（DE值）控制在15%～20%時(shí)，利于后續(xù)糖化與發(fā)酵。α-淀粉酶添加量＞8 U/g時(shí)，DE值過(guò)高，生成的糊精分子太小，不利于后續(xù)糖化酶構(gòu)成絡(luò)合結(jié)構(gòu)，影響糖化酶的催化效率[24]。因此，最適α-淀粉酶添加量為6 U/g。

圖3 α-淀粉酶添加量對(duì)葡萄糖當(dāng)量值的影響Fig.3 Effect of α-amylase addition on dextrose equivalent value

2.1.4 液化溫度對(duì)液化效果的影響

玉米淀粉的糊化溫度是65～75 ℃，糊化過(guò)程淀粉顆粒吸水膨脹，晶體結(jié)構(gòu)破壞，有利于液化過(guò)程酶與底物作用，淀粉分子形成低分子糊精溶液。由圖4可知，在液化溫度為80 ℃時(shí)DE值最高，在溫度高于80 ℃后DE值有所降低。這是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度的升高而增快，至最適反應(yīng)溫度后，繼續(xù)升高溫度會(huì)造成部分酶的失活，使反應(yīng)速度下降[25]。因此，最適液化溫度為80 ℃。

圖4 液化溫度對(duì)葡萄糖當(dāng)量值的影響Fig.4 Effect of liquefaction temperature on dextrose equivalent value

2.1.5 液化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，考察液化時(shí)間、α-淀粉酶量、液化溫度3個(gè)因素對(duì)玉米粉液化程度的影響，選擇合適的水平范圍，以DE值為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)確定最優(yōu)液化條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

表1 玉米粉液化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for liquefaction conditions optimization of corn flour

表2 玉米粉液化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results for liquefaction conditions optimization of corn flour

由表1可知，液化工藝條件對(duì)于液化程度的影響主次順序?yàn)锳＞B＞C，即液化溫度＞α-淀粉酶量＞液化時(shí)間，最優(yōu)液化工藝條件組合為A2B3C2，即液化溫度80 ℃、α-淀粉酶量8 U/g、液化時(shí)間60 min。在此最佳液化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，液化液DE值為20.6%。

從表2可以看出，液化條件對(duì)液化程度的影響均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。因此在玉米粉糖液液化時(shí)，液化溫度、α-淀粉酶量和液化時(shí)間這3個(gè)因素都要考慮。

2.2 玉米粉糖液最佳糖化工藝條件的確定

2.2.1 糖化時(shí)間對(duì)糖化效果的影響

圖5 糖化時(shí)間對(duì)葡萄糖當(dāng)量值的影響Fig.5 Effect of saccharification time on dextrose equivalent value

由圖5可知，糖化時(shí)間8 h之前，隨著時(shí)間的推移糖化醪的DE值大幅度提高；在糖化時(shí)間8～14 h時(shí)DE值提高不大，逐漸趨于平緩；糖化時(shí)間＞14 h之后，DE值增加不明顯，其原因是糖化酶底物專一性很低，除能從淀粉分子非還原末端切開(kāi)α-1,4糖苷鍵之外，也能切開(kāi)α-1,6糖苷鍵和切開(kāi)α-1,3糖苷鍵，但前者的速度要快于后兩種糖苷鍵；而糖化酶作用于支鏈淀粉時(shí)，從非還原末端順次切下葡萄糖單位，遇到α-1,6糖苷鍵分支處，先將α-1,6糖苷鍵切開(kāi)，再將α-1,4糖苷鍵水解，故水解支鏈淀粉的速度受水解α-1,6糖苷鍵速度的控制[26]。因此，考慮提高設(shè)備利用率和節(jié)約時(shí)間，選擇最優(yōu)糖化時(shí)間為10 h。

2.2.2 糖化酶添加量對(duì)糖化效果的影響

圖6 糖化酶添加量對(duì)葡萄糖當(dāng)量值的影響Fig.6 Effect of glucoamylase addition on dextrose equivalent value

糖化醪底物濃度足夠高時(shí)，隨著加酶量的增加糖化程度也隨之增加[27]。由圖6可知，隨著糖化酶添加量的增加，糖化醪DE值逐漸增加，當(dāng)糖化酶加量為200 U/g原料，DE值達(dá)到高峰，之后隨著加酶量增加，DE值增加量趨于平衡，這是因?yàn)樘腔柑砑恿康蜁r(shí)，漿液中酶沒(méi)達(dá)到飽和，酶促反應(yīng)不充分，還原糖產(chǎn)量較低，當(dāng)酶量達(dá)到飽和后，加酶量的增加對(duì)反應(yīng)影響不大，還原糖的增加量變化不明顯，因此，綜合考慮成本和糖化酶解效果，選擇最適加酶量為200 U/g。

2.2.3 糖化溫度對(duì)糖化效果的影響

糖化溫度能顯著影響酶促反應(yīng)，在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)隨著溫度的升高加快，至最適反應(yīng)溫度時(shí)到達(dá)最快。若溫度繼續(xù)升高，會(huì)導(dǎo)致酶失活，使得酶促反應(yīng)速度降低[28]。由圖7可知，DE值在糖化溫度低于60 ℃范圍內(nèi)逐漸升高，但糖化溫度高于65 ℃后糖化酶失活嚴(yán)重，DE值降低。因此，選擇最適糖化溫度為60 ℃。

圖7 糖化溫度對(duì)葡萄糖當(dāng)量值的影響Fig.7 Effect of saccharification temperature on dextrose equivalent value

2.2.4 糖化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，以DE值為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)確定最優(yōu)糖化工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 玉米粉糖化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for saccharification conditions optimization of corn flour

續(xù)表

表4 玉米粉糖化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results for saccharification conditions optimization of corn flour

由表3可知，糖化工藝條件的主次順序?yàn)樘腔瘻囟龋咎腔柑砑恿浚咎腔瘯r(shí)間；得到最佳糖化工藝條件組合為A2B3C3，即糖化溫度60 ℃，糖化酶添加量250 U/g，糖化時(shí)間12 h。在此優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，糖化液DE值為93.1%。由表4可知，糖化酶添加量和糖化時(shí)間對(duì)結(jié)果均有顯著的影響（P＜0.05），糖化溫度對(duì)結(jié)果有極顯著的影響（P＜0.01）。因此，在玉米粉糖液糖化時(shí)，溫度、糖化酶添加量和時(shí)間這三個(gè)因素都要考慮。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素與正交試驗(yàn)確定了玉米粉糖液的最佳液化和糖化工藝條件，即最佳液化工藝條件為液化溫度80 ℃、α-淀粉酶添加量為8 U/g、液化時(shí)間60 min；最佳糖化條件為糖化溫度60 ℃、糖化酶添加量250 U/g、糖化時(shí)間12 h。在此最佳工藝條件下，制備的玉米粉糖液DE值達(dá)93.1%，且糖液澄清度高，提高了玉米粉糖液的質(zhì)量和得率。本研究及結(jié)果可為玉米粉糖液雙酶法的工業(yè)化提供理論依據(jù)。