L-天冬氨酸的提取工藝優化

徐 慧，崔 穎，王珊珊，田延軍，朱坤福，祝 蕾，賀強之，姜國政，韓延雷，黃艷紅，劉建軍*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院），山東省食品發酵工業研究設計院，山東濟南 250013；2.煙臺恒源生物股份有限公司，山東煙臺 265709；3.山東朱氏藥業集團有限公司，山東菏澤 274300）

L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）又名α-氨基丁二酸，是一種重要的酸性氨基酸[1]，廣泛應用于食品、醫藥、化工等領域。在食品工業方面，L-天冬氨酸是多種食品的營養增補劑，還用于合成甜味劑阿斯巴甜[2]；在醫藥方面，其可用作肝功能促進劑、氨解毒劑和疲勞恢復劑等[3-5]，且還是合成L-丙氨酸的主要原料和多種醫藥中間體[6]；在化工方面，其可用于合成高分子材料聚天冬氨酸[7]。

L-天冬氨酸可以通過傳統發酵法、固定化酶或固定化細胞法和游離整體細胞法進行工業化生產。其中，游離整體細胞法是目前主要的工業生產方法，即利用產生L-天冬氨酸酶的菌種將富馬酸與氨直接轉化生產L-天冬氨酸。1974年，日本田邊制藥公司利用反丁烯二酸發酵技術率先實現了工業化生產[8-9]。我國在20世紀80年代中后期開始研制和開發L-天冬氨酸，首先以物理或化學方法將酶制劑包埋或吸附在固相中催化富馬酸和氨進行連續生產[10]，由于固定化后酶的穩定性降低，故在此基礎上研發了固定化細胞法。徐禮生等[11]以反丁烯二酸和氨水為底物，采用天冬氨酸酶基因工程菌固定化細胞生物催化法合成L-天冬氨酸，產率達到96.7%。固定化法生產L-天冬氨酸存在工藝設備投入多、技術要求高、操作復雜等問題，進一步技術改進幾乎不可能。1996年，徐虹等[12]以大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC11303培養液作酶源，采用游離酶法由富馬酸轉氨生成L-天冬氨酸。取培養26 h左右的培養液，37 ℃酶反應6 d，可轉化富馬酸9 kg/L。2000年，王雪根等[13]游離整體細胞法生產L-天冬氨酸，轉化率平均在99%以上。隨后很多研究者從篩選高產天冬氨酸酶菌株[14]、天冬氨酸酶改造[15]、培養基及培養條件[16-18]等方面對此生產工藝進行優化，以提高L-天冬氨酸合成效率。

游離整體細胞法生產L-天冬氨酸的工藝路線成熟，生產效率高，但L-天冬氨酸轉化液中含有菌體、色素等雜質，需用活性炭對其進行凈化處理。另外，L-天冬氨酸的提取是用硫酸將pH 8.5左右的酶轉化液調至其等電點2.8，結晶沉淀后，再經過濾、干燥得到成品[19]。L-天冬氨酸在等電點附近迅速結出，會包結部分母液，使產品質量受到影響。為此，本研究對L-天冬氨酸提取工藝過程進行了優化，旨在為實現高光學純度及醫藥級等高端產品的規模化生產提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌HY-05C：煙臺恒源生物股份有限公司。

1.1.2 培養基

斜面培養基：玉米漿干粉3 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨1 g/L，氯化鈉5 g/L，硫酸錳0.05 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2。

發酵培養基：富馬酸10 g/L，玉米漿干粉8 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨7 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，用氨水調節pH值至6.0。

1.1.3 試劑

767型活性炭：安徽大別山活性炭有限公司；富馬酸（分析純）：煙臺恒源生物股份有限公司；玉米漿干粉（生化試劑）：山東康源生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；氨水（分析純）：武漢制氨廠；L-天冬氨酸標準品（色譜純）：美國Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.4 底物溶液

富馬酸200 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，氨水調節pH值至9.0，45 ℃，備用。

1.2 儀器與設備

XNP-9052BS-III生化培養箱：上海馨朗電子科技有限公司；SPH恒溫培養振蕩器：上海世平實驗設備有限公司；722型分光光度計：上海天普分析儀器有限公司；PY-P10 pH計、BSA124S-CW電子分析天平：德國賽多利斯集團；U3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：戴安（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 轉化培養液的制備

取一環活化后斜面菌體接入500 mL（裝液量50 mL）搖瓶中，200 r/min、35～37 ℃培養8 h，得到一級培養液；將一級種子液按1%（V/V）接種量轉接到發酵培養基中，200 r/min培養10 h，得到二級培養液。

1.3.2 酶法轉化反應

大腸桿菌培養液與底物溶液按1∶7（V/V）混合搖勻，于45 ℃進行轉化反應，利用高錳酸鉀滴定法[20]測定富馬酸濃度，待底物溶液中的富馬酸濃度降至0.2%以下，結束反應。

1.3.3L-天冬氨酸提取工藝流程

1.3.4 脫色條件確定

（1）脫色溫度的選擇：在1 L轉化液中加入0.10%活性炭，設置脫色溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，脫色時間1 h條件下過濾，波長640 nm條件下測定透光率，考察溫度對脫色效果的影響。

（2）活性炭用量的選擇：在1 L轉化液中，設置活性炭用量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，脫色溫度60 ℃，脫色時間1 h條件下過濾，波長640 nm條件下測定透光率，考察活性炭用量對脫色效果的影響。

1.3.5 硫酸酸化工藝優化單因素試驗

取600 mL濾液，加入60 mL硫酸，分別設置結晶溫度75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，硫酸滴加速度10mL/h、20mL/h、30 mL/h、40 mL/h、50 mL/h，冷卻時間5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，考察其對L-天冬氨酸含量的影響。

1.3.6 硫酸酸化工藝優化響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以結晶溫度（A）、硫酸滴加速度（B）、冷卻時間（C）進行Box-Behnken響應面試驗設計，以L-天冬氨酸含量（Y）為響應值，進行提取工藝的優化。試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments desigh

1.3.7 測定方法

透光率測定：分光光度法，純水作參比，10 mm光程，波長640 nm。

L-天冬氨酸含量測定：高效液相色譜法，SinoChrom ODS-BP C18（5 μm×4.6 mm×250 mm）分析柱；流動相為0.03 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液（pH2.5）；檢測波長210 nm；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 脫色條件的確定

2.1.1 溫度對脫色的影響

溫度對脫色效果的影響見圖1。由圖1可知，在溫度為30～60℃時，轉化濾液透光率隨溫度的升高呈快速上升趨勢；當溫度為60 ℃時，透光率最高，達到96.4%；在溫度高于60 ℃之后，透光率逐漸降低。因此，選擇最適脫色溫度為60 ℃。

圖1 溫度對脫色的影響Fig.1 Effect of temperature on decolorization

2.1.2 活性炭用量對脫色的影響

活性炭用量對脫色效果的影響見圖2。由圖2可知，隨著活性炭用量在0.05%～0.15%范圍內增加，轉化液濾液透光率隨之逐漸增大，當活性炭用量為0.15%時，透光率達到最大值，為99.6%；當活性炭用量＞0.15%之后，透光率不再有明顯增加。且考慮到活性炭用量過大，一方面增加成本，另一方面其會吸附部分氨基酸，從而影響產品收率，因此，選擇活性炭用量為0.15%。

圖2 活性炭用量對脫色的影響Fig.2 Effect of active carbon addition on decolorization

2.2 硫酸酸化工藝優化單因素試驗

2.2.1 結晶溫度對L-天冬氨酸含量的影響

結晶溫度對L-天冬氨酸含量的影響見圖3。由圖3可知，隨著結晶溫度在75～90 ℃范圍內的上升，L-天冬氨酸含量不斷增加；當結晶溫度為90 ℃時，L-天冬氨酸含量達到最大值，為94.51%；當結晶溫度高于90 ℃之后，L-天冬氨酸含量下降。因此，選擇最適結晶溫度為90 ℃。

圖3 結晶溫度對L-天冬氨酸含量的影響Fig.3 Effect of crystallization temperature on L-aspartic acid content

2.2.2 硫酸滴加速度對L-天冬氨酸含量的影響

硫酸滴加速度對L-天冬氨酸含量的影響見圖4。由圖4可知，在硫酸滴加速度為10～20 mL/h時，L-天冬氨酸含量隨硫酸滴加速度增加呈現上升的趨勢；當硫酸滴加速度為20 mL/h時，L-天冬氨酸含量達到最大值，為95.3%；當硫酸滴加速度＞20 mL/h之后，L-天冬氨酸含量逐漸降低。因此，選擇最適硫酸滴加速度為20 mL/h。

圖4 硫酸滴加速度對L-天冬氨酸含量的影響Fig.4 Effect of dropping rate of sulfuric acid on L-aspartic acid content

2.2.3 冷卻時間對L-天冬氨酸含量的影響

圖5 冷卻時間對L-天冬氨酸含量的影響Fig.5 Effect of cooling time on L-aspartic acid content

冷卻時間對L-天冬氨酸含量的影響見圖5。由圖5可知，在冷卻時間為5～10 min時，隨著冷卻時間增加，L-天冬氨酸含量增加；當冷卻時間為10 min時，L-天冬氨酸含量達到最大值，為96.15%；冷卻時間＞10 min之后，L-天冬氨酸含量逐漸降低。因此，選擇最適冷卻時間為10 min。

2.3 硫酸酸化工藝優化響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，以L-天冬氨酸含量（Y）為響應值，選取結晶溫度（A）、硫酸滴加速度（B）、冷卻時間（C）進行3因素3水平的Box-Behnken優化試驗設計。試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用軟件Design-Expert 8.0.6對表2中試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到回歸方程為：

由表3可知，該模型極顯著（P＜0.01），決定系數R2為0.950 9，失擬項不顯著（P＞0.05），說明試驗誤差小且擬合度較高，可以應用于試驗的分析預測。影響L-天冬氨酸含量的因素順序為冷卻時間＞硫酸滴加速度＞結晶溫度，其中各因素中一次項C、二次項C2對結果影響均達到極顯著水平（P＜0.01），一次項B、二次項B2對結果影響達到顯著水平（P＜0.05）。

響應面及等高線圖能夠直觀地反映出各因素的交互作用對響應值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，對相應值影響越顯著[21]。根據回歸方程得到結晶溫度、硫酸滴加速度和冷卻時間之間的交互作用對L-天冬氨酸含量影響的響應面及等高線見圖6。

圖6 各因素交互作用對L-天冬氨酸含量影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction among various factors on L-aspartic acid content

由圖6可知，各交互因素的最佳作用點基本都落在試驗范圍內，經過軟件分析得到最佳提取工藝條件為結晶溫度90.76 ℃，硫酸滴加速度23.19 mL/h，冷卻時間12.48 min。在此優化條件下L-天冬氨酸含量預測值為98.60%。

2.4 驗證試驗

考慮到實際需要對上述工藝條件進行調整，即結晶溫度91 ℃，硫酸滴加速度23 mL/h，冷卻時間12 min。在此條件下進行3組平行試驗，測得L-天冬氨酸含量實際值為98.22%，與預測值接近，表明采用響應面優化方法得到的數據準確可靠，具有實用價值。

3 結論

以大腸桿菌發酵液為原料，采用硫酸萃取法提取L-天冬氨酸。利用單因素和響應面試驗，優化確定了最適脫色條件為脫色溫度60 ℃，活性炭添加量0.15%；最佳酸化工藝條件為結晶溫度91 ℃，硫酸的滴加速度23 mL/h，冷卻時間12 min，在此工藝條件下L-天冬氨酸含量為98.22%，較優化前提高了7.42%。