QuEChERS-UPLC-MS/MS法測定熱帶和亞熱帶水果中5種三唑類殺菌劑

田金鳳，尚遠宏*

（攀枝花學院醫學院，四川攀枝花 617000）

四川省攀枝花市位于亞熱帶地區，且具有以南亞熱帶為基帶的島狀式立體氣候和充足的光熱，盛產熱帶和亞熱帶水果。石榴、芒果、火龍果作為攀枝花主要熱作水果，隨著種植面積逐年擴大，病害程度隨之增加[1-3]，而生產過程中殺菌劑施用不合理，造成3種水果農藥殘留問題日益凸顯，導致其安全性受到影響，因而高效檢測石榴、芒果、火龍果中的殺菌劑殘留變得非常重要。

三唑類殺菌劑為全球殺菌劑類別中品種最多的一個大類[4]，具有高效、內吸、廣譜等特點，可防治果樹及其他作物的多種銹病、白粉病、葉斑病、根腐病、炭疽病等病害[5]。在GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中，石榴、芒果和火龍果屬于皮不可食的熱帶和亞熱帶水果，且對于標準規定食品中農藥最大殘留限量，芒果有3種專屬（直接檢測）的三唑類殺菌劑（戊唑醇、苯醚甲環唑、腈菌唑）、石榴有2種專屬的三唑類殺菌劑（苯醚甲環唑、腈菌唑）、火龍果無檢測的殺菌劑[6]。同時，現執行的國家標準GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》前處理操作繁瑣，成本高，費時費力，不適合大批量樣品的快速定性及定量分析[7]；且尚未見同時檢測三唑酮、戊唑醇、丙環唑、苯醚甲環唑、腈菌唑等5種三唑類殺菌劑的殘留報道。因此，探討并建立檢測皮不可食的熱帶和亞熱帶水果（以石榴、芒果和火龍果為研究對象）中5種低毒內吸性三唑類殺菌劑殘留標準具有實際意義。

高通量檢測蔬菜及水果中農藥殘留的最有效和快速的前處理凈化方法是QuEChERS法[8]，而超高效液相色譜-串聯質譜法（ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）是農藥殘留分析的熱點技術之一[9-10]，但二者結合分析時，由于樣品提取溶劑及量的變化，可能會造成環境污染和溶劑效應，因此本實驗對QuEChERS填料和提取溶劑、體積、提取次數等進行篩選，采用UPLC-MS/MS法測定3種水果中5種殺菌劑殘留，以期為國家或行業標準中關于皮不可食的熱帶和亞熱帶水果的農藥最大殘留限量檢測指標增加和方法建立的制定提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

芒果、石榴、火龍果：攀枝花地區采摘。

1.1.2 化學試劑

甲醇（色譜級）：美國Fisher公司；農藥（三唑酮、戊唑醇、丙環唑、苯醚甲環唑、腈菌唑）標準品（純度均＞98%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯四級桿質譜儀：美國Agilent公司；1-14k離心機：美國Sigma公司；FA2014B電子天平：上海越平公司；Milli-Q IQ7000超純水器：美國Millipore公司；Vortex 4渦旋混合器：比利時LMS公司；NEVAP-45氮吹儀：美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

4 mmol/L甲酸的水溶液：準確吸取0.15 mL甲酸，用水稀釋并定容至1 L。

標準溶液的配制：分別準確稱取適量5種三唑類殺菌劑標準品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，-20 ℃避光保存。其他濃度標準溶液用甲醇定量稀釋即得。

1.3.2 樣品前處理

芒果去皮去核取可食用部分、石榴去皮取可食用部分、火龍果去葉冠取可食用部分，分別稱取10.0 g石榴、芒果、火龍果樣品（精確至0.01 g），分別置于50 mL聚丙烯刻度離心管中，加入10 mL0.5%甲酸乙腈溶液[11]，振蕩渦旋20 min，加入氯化鈉1 g和無水硫酸鎂5 g[12-14]，立即渦旋混勻10 s，然后10 000 r/min離心5 min，取上清液5.0 mL，加入QuEChERS試劑管中渦旋混勻1 min，10 000 r/min離心3 min，取上清液0.5 mL，用水定容至1 mL，混勻后14 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，即得。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：4 mmol/L甲酸的水溶液-甲醇[15-16]，梯度洗脫；流速：0.2 mL/min；進樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序：0～7.5 min，甲醇體積分數由30%升至90%；7.5～10 min，甲醇體積分數為90%；10～10.5 min，甲醇體積分數由90%降至30%；10.5～15 min，甲醇體積分數為30%。質譜條件：離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監測（multiple-reaction monitoring，MRM）；霧化氣壓力45 psi；輔助氣（auxiliary gas flow，AUX）流速11 L/min；輔助氣溫度300 ℃；電噴霧電壓4 000 V[17]。

5種三唑類殺菌劑的多反應監測質譜參數見表1。

表1 多反應監測模式下5種三唑類殺菌劑的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters of 5 kinds of triazole fungicides under multiple reaction monitoring mode

1.3.4 標準曲線的繪制及檢出限的測定

配制好的5種三唑類殺菌劑標準儲備液用甲醇稀釋成400 μg/L混合標準溶液，分別用空白石榴、芒果、火龍果基質提取液將混合標準溶液稀釋成200 μg/L、100 μg/L、80 μg/L、40 μg/L、20 μg/L、10 μg/L、4 μg/L系列質量濃度的混合標準溶液分別進樣測定。以質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，采用外標法建立標準曲線。以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）分別確定檢出限（limit of detection，LOD）與定量限（limit of quantitation，LOQ）[18-20]。

1.3.5 加標回收率和精密度測定

空白的芒果、石榴、火龍果各樣品分別添加標準液（5 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg）3個水平下，搖勻、靜置后按1.3.2方法處理，進行空白加標回收率試驗。同時，每個水平重復6次，測定平均回收率和精密度相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 數據處理

實驗所得數據為3次重復實驗的平均值，采用Microsoft Excel 2010軟件對實驗數據進行統計分析，通過Origin7.5軟件進行制圖分析。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

5種三唑類殺菌劑的MRM色譜圖見圖1，二級離子質譜圖見圖2。

圖1 100 μg/L混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 100 μg/L mixed standard solution

圖2 5種殺菌劑的二級離子質譜圖Fig.2 Secondary ion mass spectrometry of 5 kinds of triazole fungicides

由圖1可知，三唑酮、腈菌唑、戊唑醇、丙環唑和苯醚甲環唑經色譜分離流出的組分不斷進入質譜，質譜連續掃描進行數據采集，每一次掃描得到一張質譜圖，將每一張質譜圖中所有離子強度相加，得到一個混合標準溶液總的離子流強度。由圖2可知，定量離子色譜圖反映了（目標化合物的特征離子）色譜峰的定性，峰的一致性測定。

2.2 方法的線性關系及檢出限

5種三唑類殺菌劑的標準曲線線性回歸方程、相關系數R2、線性范圍及檢出限見表2。由表2可知，5種三唑類殺菌劑在4.0～200.0 μg/L質量濃度范圍內的相關系數R2均＞0.999，檢出限（LOD）為0.05～0.3 μg/kg，定量限（LOQ）為0.15～1.0 μg/kg，低于國家規定的最大殘留限量值[12]。

表2 5種殺菌劑的線性回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限、定量限Table 2 Linear regression equation,range,correlation coefficient,limit of detection and limit of quantitation of 5 kinds of fungicides

2.3 方法的回收率與精密度

表3 5種殺菌劑的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Standard recovery rates and relative standard deviations of 5 kinds of fungicides (n=6)

續表

由表3可知，分別以5 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg的水平將5種三唑類殺菌劑添加到空白芒果基質中，測定回收率，5種三唑類殺菌劑在凱特芒果中的回收率范圍為87.7%～103.1%，RSD為4.1%～11.2%；以5 μg/kg、20 μg/kg、80 μg/kg的水平將5種三唑類殺菌劑添加到空白石榴基質、火龍果基質中，測定回收率，5種三唑類殺菌劑的回收率范圍分別為80.5%～93.5%，81.6%～94.7%；RSD分別為3.8%～7.3%，4.3%～10.2%；結果表明，該方法準確度和精密度滿足農藥定量分析要求[21]。

2.4 實際樣品分析

按選定的試驗方法下，對攀枝花地區的各20份突尼斯軟籽石榴、凱特芒果、紅心火龍果進行分析，三唑酮等5種三唑類殺菌劑的殘留量均低于檢測限，均未檢出。

食品安全國家標準的檢測方法中含5種農藥殘留以適用于“其他食品”或“其他蔬菜和水果”可參照執行的檢測方法相比，GB 23200.8—2016中規定LOQ的三唑酮（0.025 0 mg/kg）、腈菌唑（0.012 6 mg/kg）、丙環唑（0.037 6 mg/kg）和戊唑醇（0.037 6 mg/kg）[22]；GB 23200.49—2016中苯醚甲環唑的LOQ為0.005 mg/kg[23]；均比本研究中5種相應三唑類殺菌劑的殘留LOQ規定值大，而定量限是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，本方法從定量限方面體現了分析方法具備了更靈敏的定量檢測能力，能滿足3種水果中5種三唑類殺菌劑殘留檢測的要求。

3 結論

本實驗結合固相萃取技術，以高效液相色譜－串聯質譜法建立了攀枝花本地的突尼斯軟籽石榴、凱特芒果、紅心火龍果中5種低毒內吸性三唑類殺菌劑殘留的分析測定方法。該方法前處理操作簡單，凈化效果好，靈敏度高，干擾少，其LOQ可達到0.15 μg/kg，在實際檢測中具有較強的可行性和實用性，也適用于各水果中5種農藥殘留的定性和定量分析，且對于未來“食品中農藥最大殘留限量”標準的完善3種熱作水果中多種三唑類殺菌劑殘留的檢測方法和限量標準的制定是十分必要的。