復合微生物的篩選及其發酵秸稈的應用效果

曾佳佳，陳 靜，陳 振，黨士坤，徐海燕，谷 巍，曹 斌

（山東寶來利來生物工程股份有限公司山東省動物微生態制劑重點實驗室，山東泰安 271000）

我國農作物秸稈的產量高，利用率低，焚燒和堆放在田間地頭會造成巨大的資源浪費和環境污染。秸稈主要含有纖維素、半纖維素、木質素、蛋白質及灰分物質，前三種的含量占80%以上，纖維素類物質在自然狀態下降解率不高，往往降低了秸稈的再利用水平[1-2]。

目前秸稈的綜合利用有多種途徑。秸稈能源化會產生二次污染并且總利用率低。直接還田的降解周期長，還會增加來年耕作難度；作為動物飼料，由于其纖維素、半纖維素和木質素的含量高，蛋白含量低，適口性差，使得秸稈的消化率低和營養價值低，有效提高消化率和營養價值可以改善秸稈的再利用價值[4]；堆漚還田是利用微生物將大部分有機質轉化為腐殖質，使秸稈中的氮磷鉀等被轉化為可利用的狀態再應用于土壤中[5]。

微生物發酵秸稈可以降低其纖維素、木質素含量，并提高蛋白含量，提高秸稈飼料的營養價值和利用率。微生物的生長和繁殖會分泌大量酸類、酶類，酶類可以將秸稈中的木聚糖鏈和木質素聚合物酯鏈進行酶解[6-8]，酸類可以軟化秸稈[9]。發酵過程中有益微生物的繁殖還會抑制其他有害細菌的生長。自然環境中秸稈降解緩慢，纖維素酶活力低限制著纖維素的降解，制約著秸稈的再利用，在秸稈中加入微生物有助于加快秸稈的降解[10-11]。本研究為了提高秸稈的發酵效果，通過測定復合微生物發酵秸稈過程中的酶活，篩選出纖維素酶活和木聚糖酶活力高的復合微生物，將其應用于秸稈發酵，測定秸稈成分（粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質素、粗蛋白）的變化，為復合微生物應用于秸稈發酵提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

供試菌株黑曲酶（Aspergillus niger）0002、黑曲酶（Aspergillus niger）0007、黑曲酶（Aspergillus niger）0011、米曲酶（Aspergillus oryzae）0008、白腐菌（white rot fungi）0126、芽孢桿菌（Bacillus）0136和放線菌（Actinomyces）0057等：山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存；玉米秸稈、小麥秸稈：泰安市農業科學院的種植基地。

1.1.2 化學試劑

硫酸（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；氯化鈉、硫酸亞鐵、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（均為分析純）：天津凱通化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津北辰方正試劑廠；木糖、葡萄糖（均為分析純）：天津大茂化學試劑廠；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：上海中秦化學試劑有限公司；無水亞硫酸鈉、羧甲基纖維素鈉（carboxymethy cellulose-Na，CMC-Na）（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；木聚糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；醋酸、醋酸鈉（均為分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；硫酸鎂（分析純）：濟南匯豐達化工有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母膏（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司。

1.1.3 培養基

黑曲霉和米曲霉培養基：稱量麩皮30 g，加入20 mL水，121 ℃滅菌30 min。

芽孢桿菌培養基：葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.5%，pH調至7.0，121 ℃滅菌30 min。

放線菌培養基：可溶性淀粉2%，硝酸鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.05%，硫酸亞鐵0.001%，pH調至7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

白腐菌培養基：馬鈴薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，121 ℃滅菌30 min。

剛果紅纖維素鑒別培養基：CMC-Na 10 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，NaCl 1.5 g，剛果紅0.2 g，水1 L，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

DHP-9082數顯恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱：常州諾基儀器有限公司；KDN-103F自動定氮儀、HYP308消化爐：上海纖檢儀器有限公司；LD5-2A低速離心機：北京京立離心機有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；722E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；YXQ-LS-50S11壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；pHS-3C型pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養及其篩選

分別用接種環取黑曲酶、米曲霉、芽孢桿菌、白腐菌、放線菌斜面于裝有對應培養基的三角瓶中，芽孢桿菌于37 ℃、180 r/min搖床培養24 h。黑曲酶和米曲霉于30 ℃培養箱中靜置培養72 h。白腐菌和放線菌于30 ℃、180 r/min搖床培養72 h。

將制備的菌液滴到剛果紅培養基上進行培養，培養菌落至周圍出現透明圈后，用0.02%剛果紅溶液染色20 min，1 mol/L氯化鈉溶液脫色20 min后計算透明圈直徑D、菌落直徑d。根據透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（H=D/d）來初步判斷該待測菌株降解纖維素的能力，H值越大表明該待測菌株降解纖維素的能力越強，初篩H值大的菌株。

1.3.2 復合菌株的篩選及發酵玉米秸稈

在初篩菌株的基礎上，將發酵菌株組合分別設計為：①白腐菌0126+黑曲酶（0007、0011、0002）[1∶1（0.33∶0.33∶0.33）]；②白腐菌0126+米曲霉0008（1∶1）；③白腐菌0126+黑曲霉（0007、0011、0002）+米曲霉0008[1∶1（0.33∶0.33∶0.33）∶1]；④白腐菌0126+黑曲霉（0007、0011、0002）+米曲霉0008+芽孢桿菌0136+放線菌0057[1∶1（0.33∶0.33∶0.33）∶1∶1∶1]。

將玉米秸稈剪碎至3～5 cm長度，加入培養基（秸稈∶麩皮=7∶3，（NH4）2SO41%，KH2PO40.2%，料水比1∶4（g∶mL））后在密封袋中充分混勻，于121 ℃滅菌30 min，冷卻后分別按照接菌量1%接入4種組合的菌，于30 ℃條件下發酵，保持通風，根據腐化程度于第15天時結束發酵。同時設置自然發酵對照組（不接菌）。發酵不同的時間（1d、3d、6d、9d、12d、15 d）進行取樣測定纖維素酶活、木聚糖酶活。木聚糖酶是半纖維素復合酶的主要成分，木聚糖酶活越高則半纖維素酶活越高，因此，可以用木聚糖酶活來反映半纖維素酶活的情況。

1.3.3 復合菌株發酵田間大堆小麥秸稈

在田間用小麥秸稈堆成圓錐形堆體，堆體高度約1.2 m，直徑約2.0 m，每個堆體約50 kg干秸稈。堆體的底部、表面都用塑料布鋪蓋。秸稈中加入玉米面6.1%，尿素1%，料水比1∶1（g∶mL），按照1%的接菌量分別接入白腐菌、黑曲霉、米曲霉、芽孢桿菌和放線菌（1∶1∶1∶1∶1）。每天記錄堆體的溫度，分別在發酵第5、10、15、20天時翻堆補水（以手握時指縫有水但不下滴為宜）。觀察堆體的形貌變化，定期取樣測定pH、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質素、粗纖維和粗蛋白，發酵38 d時外觀腐化程度良好，即可結束發酵。

1.3.4 粗酶液的制備

取發酵秸稈樣品3 g，加30 mL蒸餾水，在室溫下浸提4 h后用4層紗布過濾，于轉速為3 500 r/min條件下離心10 min，上清液即為粗酶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.5 分析檢測

（1）纖維素酶活測定

纖維素酶酶活采用羧甲基纖維素糖化力法[12]。纖維素酶酶活定義：在40 ℃、pH 4.6的條件下，1 min水解羧甲基纖維素產生1.0 μg葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位（U/g）。

（2）木聚糖酶活測定

木聚糖酶酶活測定參考國標GB/T 23874—2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度法》。木聚糖酶酶活定義：在37 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘從質量濃度為5 mg/mL的木聚糖溶液中降解釋放1 mol還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/g）。

（3）組分及pH值測定

粗纖維含量：參照國標GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維的含量測定過濾法》；中性洗滌纖維含量：參照國標GB/T 20806—2006《飼料中中性洗滌纖維（NDF）的測定》；酸性洗滌纖維含量：參照農業行業標準NY/T 1459—2007《飼料中酸性洗滌纖維的測定》；木質素含量：參照國標GB/T 20805—2006《飼料中酸性洗滌木質素（ADL）的測定》；粗蛋白含量：參照國標GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》；pH的測定：采用玻璃電極pHS-3C型pH計。

1.3.6 統計分析

使用Excel 2007軟件對原始數據進行處理，采用SPSS 17.0統計軟件（One-Way ANOVA）進行顯著性分析，并采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法進行多重比較，結果用平均值±標準誤差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 纖維素分解能力菌株的篩選

通過剛果紅纖維素鑒別培養基培養后，只有纖維素分解菌周圍才會形成透明圈。本實驗對本公司菌種庫中的7株菌進行篩選，結果見表1。由表1可知，7株菌均能觀察到透明圈，可以產降解纖維素酶，能夠用于降解秸稈的試驗。

表1 不同菌株的透明圈直徑D與菌落直徑d的比值HTable 1 Ratio value H of transparent ring diameter D to colony diameter d of different strains

2.2 不同組合復合株菌發酵玉米秸稈的纖維素酶活和木聚糖酶活

纖維素酶可以將纖維素分解成寡糖或單糖。木聚糖是植物中半纖維素的重要組成部分，在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素。木聚糖酶能夠降解木聚糖生成木寡糖、木糖等低聚木糖混合物及葡萄糖等[13]，這兩種酶活力越高，越有利于降解秸稈中的纖維素和半纖維素。木聚糖酶和纖維素酶可以通過物理或化學作用直接或間接使秸稈的纖維結構得到膨脹甚至破壞[14]。

圖1 不同菌株組合發酵玉米秸稈的纖維素酶活（A）及木聚糖酶活（B）Fig.1 Cellulase (A) and xylanase (B) activities of corn straw fermented by different combinations of strains

由圖1A可知，添加復合菌株的試驗組在發酵秸稈1～9 d時，各組纖維素酶酶活隨時間增加呈持續升高趨勢，第9天后開始下降。①組的纖維素酶酶活在發酵第9天時最高，為194.73 U/g。②組的纖維素酶酶活在發酵第9天時最高，為159.80 U/g。③組的纖維素酶酶活在發酵第3天時最高，為155.92 U/g。④組的纖維素酶酶活在發酵第9天時最高，為203.64 U/g。自然發酵對照組纖維素酶酶活在第6天時，酶活最高，為102.47 U/g。試驗組的纖維素酶活均顯著高于對照組（P＜0.05）。結果表明，④組（白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢+放線菌）的纖維素酶活最佳（203.64 U/g）。

由圖1B可知，試驗組不同的復合菌株在發酵1～9 d時，各組木聚糖酶酶活隨時間增加呈先升高后下降趨勢。①組的木聚糖酶酶活在發酵第6天時最高，為9 021.33 U/g。②組的木聚糖酶酶活在發酵第6天時最高，為8 376.55 U/g。③組的木聚糖酶酶活在發酵第9天時最高，為9 503.88 U/g。④組的木聚糖酶酶活在發酵第6、9天時最高，為100 17.41 U/g。對照組在第9天時木聚糖酶活最高，為1 189.43 U/g。試驗組的木聚糖酶活均顯著高于對照組（P＜0.05）。結果表明，④組（白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢+放線菌）的木聚糖酶活最佳（100 17.41 U/g）。

綜上所述，白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢+放線菌菌株組合可以應用于秸稈發酵。

2.3 田間大堆發酵小麥秸稈的情況

溫度為堆肥過程中微生物生命活動的重要參數，也是判斷發酵產品能否達到無害化條件的重要指標之一，發酵初期微生物的繁殖等大量活動釋放熱量，使溫度上升。高溫發酵過程能殺死其中的病菌、蟲卵和雜草種子，部分嗜溫菌受到抑制甚至死亡，需要及時降溫[15]，各溫度階段的微生物群和酶系存在著差異。白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢+放線菌菌株組合應用于小麥秸稈田間大堆發酵，發酵過程中溫度的變化見圖2，pH值變化見表2，組分變化見表3，外觀變化見圖3。

圖2 小麥秸稈發酵過程中溫度的變化Fig.2 Changes of temperature during wheat straw fermentation

由圖2可知，本次發酵過程中溫度有高溫期、中溫期和低溫期。試驗組從第3天開始迅速升溫，第4天升至60 ℃以上，第5天溫度有所下降。整個發酵過程中，溫度超過60 ℃以上的時間有4 d，超過50～60 ℃的時間有6 d，40～50 ℃的時間有8 d。基本上第24天開始，溫度都低于40 ℃。對照組從第3天開始迅速升溫，第3天升至50 ℃以上，第4天溫度有所下降。整個發酵過程中，溫度超過50 ℃以上的時間有1 d，40～50 ℃的時間有10 d。第21天開始，溫度都低于40 ℃。在第5、10、15、20天時進行翻堆補水，試驗組和對照組每翻堆一次溫度有小幅度升高。

本研究中采用翻堆來改善通風狀況，每次翻堆后溫度都有小幅度升高，有助于提高秸稈的發酵腐熟。李春燕等[16]研究發現，翻堆可延長好氧發酵高溫期。在高溫期進行翻堆2～3次，能夠更有效促進可揮發性固體的降解，提高秸稈腐殖化程度。

表2 小麥秸稈發酵過程中pH值的變化Table 2 Changes of pH during wheat straw fermentation

由表2可知，小麥秸稈堆肥初始pH值為9.33，發酵22 d后pH略微降低，仍為堿性，至發酵38 d時pH為微堿性。可能是由于發酵過程中微生物的繁殖和代謝產物產生了少量酸性物質，使pH有所下降。發酵結束秸稈pH為微堿性，符合腐熟堆肥的pH為7.5～8.5[17-18]。王瓊瑤等[19]研究了不同腐熟劑對水稻秸稈的腐熟效果，發現強微堆肥快速腐熟劑處理后，在42 d時腐熟液pH值達7.5，與本研究結果一致。

表3 小麥秸稈發酵過程中組分變化Table 3 Changes of compositions during wheat straw fermentation

由表3可知，對照組和試驗組的小麥秸稈的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質素、粗纖維隨著發酵時間的增加而逐漸降低，粗蛋白逐漸升高。

對照組發酵38 d的小麥秸稈，中性洗滌纖維、粗纖維比發酵前秸稈顯著降低（P＜0.05），粗蛋白顯著升高（P＜0.05）。

試驗組發酵38 d的小麥秸稈，中性洗滌纖維比發酵前顯著降低21.53%（P＜0.05），粗纖維顯著降低17.31%（P＜0.05），粗蛋白顯著升高95.52%（P＜0.05）。試驗組發酵38 d的秸稈中酸性洗滌纖維和木質素與未發酵時無顯著性差異（P＞0.05），酸性洗滌纖維降低7.4%，木質素降低7.16%。

試驗組發酵38 d的小麥秸稈的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質素、粗纖維分別比對照組發酵38 d的小麥秸稈降低了11.36%、6.29%、3.63%、6.95%，粗蛋白顯著升高了48.23%（P＜0.05）。

目前發現能夠降解小麥秸稈的微生物主要有細菌、真菌和放線菌，它們能夠降解纖維素、半纖維素和木質素，還會影響蛋白質的含量[20-21]。喬君毅等[22]利用黑曲霉3.3148菌株發酵玉米秸稈，粗蛋白含量提高了11.26%，粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量分別下降了24.45%、45.24%、37.04%；黑曲霉產生的羧甲基纖維素酶活力為29.94 IU/g。

由圖3可知，添加復合微生物的發酵秸稈比自然發酵對照組外觀腐化程度高。可能微生物發酵改變了秸稈內部的分子結構和表觀形態。趙方圓等[23]篩選了纖維素高效降解菌曲霉YN1，并進行了降解濾紙、秸稈和稻殼的微觀形態上的觀察，對照組的稻殼表面光滑有排列整齊的突起，接菌發酵后稻殼表面呈現瓦解潰爛狀。秸稈原來是光滑的表面，發酵后菌絲定殖于秸稈的纖維表面，破壞了秸稈原有的光滑表面。

圖3 小麥秸稈發酵38 d的外觀Fig.3 Appearance of wheat straw fermentation for 38 d

3 結論

本研究篩選出復合菌株：白腐菌+黑曲霉+米曲霉+芽孢桿菌+放線菌（1∶1∶1∶1∶1），該復合菌株產纖維素酶活和木聚糖酶活較高，分別可達203.64 U/g、10 017.41 U/g。添加該復合菌株發酵秸稈，顯著降低了中性洗滌纖維、粗纖維水平（P＜0.05），顯著提高了粗蛋白水平（P＜0.05），該復合菌株可以用于秸稈發酵該復合菌有助于提高秸稈發酵效果，為秸稈的再利用提供了一種處理方法，具有廣泛的應用前景。