蘋果酵素自然發酵過程中生物活性物質的變化

張海燕，康三江 *，袁 晶，蘇渤海

（1.甘肅省農業科學院農產品貯藏加工研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術創新中心，甘肅蘭州 730070；3.咸陽市園藝站，西安咸陽 712000）

食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可供人來食用的酵素產品[1-2]。其在含有植物本身的多種維生素、酶和礦物質等營養物質的同時，還通過微生物發酵產生新的次生代謝物及活性成分，與直接食用蔬菜水果相比，酵素中的生物活性成分和有機小分子更為濃縮，而且更容易為人體所吸收[3]。食用植物酵素作為一種功能性微生物發酵制品因其豐富的營養和顯著的功效多年來盛行于歐美、東南亞、日本以及臺灣地區，受到國內外學者的普遍關注[4]，目前有關自然發酵蘋果酵素的研究多以短期發酵為主，楊小幸等[5]研究發現，蘋果酵素發酵第21天獲得了較高總酚含量與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率；李飛等[6]研究發現，發酵50 d的蘋果酵素的抗氧化活性基本呈現上升趨勢。但目前酵素研究由于發酵周期較短，致使產品品質不穩定，酒精含量容易超標，大量研究表明，酵素是時間的產物，隨著發酵時間的延長，產品中的活性物質逐漸增加[7-11]，因此，進一步闡明蘋果酵素自然發酵過程中活性物質的動態變化是很有必要的。本研究以蘋果為原料進行自然發酵，探討蘋果酵素自然發酵過程中抗氧化成分（總酚、總黃酮、維生素C（vitamin C，VC）、總花青素含量）、功效酶活性（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及抗氧化能力（DPPH自由基、·OH、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid，ABTS）自由基清除能力和還原力）等的動態變化，并對總酚、總黃酮含量、SOD活性與抗氧化能力之間的相關性進行分析。分析蘋果酵素自然發酵過程中生物活性物質的變化，以期為進一步闡明蘋果酵素保健功能機理和綜合性開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果（長富2號）：采自甘肅省慶陽市有機蘋果基地；冰糖：市售；福林-酚（Folin-Ciocalteau）、NaCO3、沒食子酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、蘆丁、抗壞血酸（VC）、鹽酸、鹽酸、氫氧化鈉、原花青素、香草醛、甲醇、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、DPPH、乙醇、ABTS、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、Tris、鄰苯三酚、淀粉酶試劑盒、鹽酸、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、聚乙烯醇、橄欖油、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、無水硫酸鈉、酒石酸鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸：中瑞化學試劑公司。實驗所用試劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

UV-1100型紫外可見分光光度計：上海凌析達儀器有限公司；LRH-70型恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DK-S24數顯恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；MIRCOCL 17R離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；MDF-U3386S超低溫冰箱：青島海爾集團；DL-CJ-1N超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；PB-10型精密pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果酵素加工工藝流程

蘋果原料選擇→清洗→去核→切分→裝罐→加水、加糖→發酵→過濾→蘋果酵素

1.3.2 操作要點

新鮮蘋果用純凈水沖洗干凈，瀝干水分后去核并切分成3～5 mm的片，冰糖破碎后用紫外燈輻照處理30 min，將蘋果片與純凈水按料液比200（g∶L）加入無菌酵素發酵罐中，加入15%的冰糖調節糖度，置于陰涼干燥的發酵車間，在常溫（20～26 ℃）條件下自然發酵30 d后，濾去果肉，繼續發酵至90 d，發酵第一個月隔天攪拌通氣，之后密封發酵，發酵結束即得蘋果酵素，取上清液進行指標測定。

1.3.3 分析檢測

（1）生物活性成分測定

總酚含量參照張靜雯[12]的方法；總黃酮含量、VC含量以及總花青素含量參照李杰等[13]的方法。蘋果酵素中生物活性成分標準曲線回歸方程及相關系數見表1。

表1 蘋果酵素生物活性成分標準曲線回歸方程Table 1 Regression equations of standard curves of bioactive components in apple Jiaosu

（2）功效酶活性

SOD活性的測定參照國標GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性》；纖維素酶活性的測定參照農業行業標準NY/T 912—2004《纖維素酶活力的測定-分光光度計法》；蛋白酶活性的測定參照商業行業標準SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》；淀粉酶活性的測定參照淀粉酶試劑盒內說明書；脂肪酶活性的測定參照國標GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中的電位滴定法。

（3）抗氧化能力

DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、還原力的測定參考樊秋元[14]的方法。

1.3.4 數據統計處理

每組試驗重復3次，試驗數據采用Excel 2010、SPSS 22.0數據分析軟件進行分析處理及作圖。

2 結果與分析

2.1 蘋果酵素自然發酵過程中生物活性成分的變化

蘋果酵素中存在總酚、總黃酮、VC和總花青素等主要生物活性成分，但含量較核桃青皮果蔬、葡萄、生姜等酵素中低[15-17]。蘋果酵素自然發酵過程中總酚、總黃酮、VC和總花青素的變化結果見圖1。

圖1 蘋果酵素自然發酵過程中生物活性成分的變化Fig.1 Changes of bioactive components during natural fermentation process of apple Jiaosu

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，總酚含量的變化呈先升高后降低趨勢，發酵0～60 d時總酚含量從0.17 mg/mL升高至1.16 mg/mL，隨后出現降低趨勢，這可能是由于部分酚類物質與發酵后期發酵液中產生的有機酸結合，生成酚酸類物質，引起總酚含量的降低[18]；隨著發酵時間在0～90 d的延長逐漸升高，總黃酮的含量從0.05 mg/mL增加至0.45 mg/mL，且發酵第1個月增加較第2個月緩慢，并于發酵60 d后緩慢增加或趨于穩定，這可能與發酵體系中微生物的多樣性有關[19]；VC和總花青素的含量在整個發酵過程中變化不大，分別基本保持在0.05 mg/mL和0.01 mg/mL的水平。表明蘋果酵素中VC和總花青素主要來源于原料中。

2.2 蘋果酵素自然發酵過程中功效酶活性的變化

蘋果酵素自然發酵過程中功效酶活性的變化結果見圖2。由圖2可知，蘋果酵素中存在SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶，且5種酶的活性均隨著發酵時間的延長呈逐漸升高趨勢，并基本于發酵60 d后緩慢增加或趨于穩定，其中SOD和纖維素酶的含量較高，發酵90 d時分別從發酵初期的9.63 U/mL和6.00 U/mL升高至42.12 U/mL和23.34 U/mL，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的含量較低，發酵初期分別為1.01 U/mL、0.81 U/mL和0.27 U/mL，發酵90 d時分別達到10.03 U/mL、6.15 U/mL和2.14 U/mL。結果表明，通過微生物發酵，可提高酵素產品發酵液中SOD、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等功效酶的活力[20]。

圖2 蘋果酵素自然發酵過程中功效酶的變化Fig.2 Changes of functional enzyme activity during natural fermentation process of apple Jiaosu

2.3 蘋果酵素自然發酵過程中抗氧化能力的變化

蘋果酵素自然發酵過程中自由基清除率的變化結果見圖3。由圖3可知，DPPH·、O2·、·OH、ABTS·清除率和還原力在蘋果酵素發酵過程中抗氧化能力的變化規律大體較為一致，DPPH自由基清除率和·OH清除率發酵前60 d逐漸上升，60 d后趨于穩定，發酵60 d時的自由基清除率分別從發酵初期的47.82%和43.05%上升至85.29%和78.85%；O2·清除率、ABTS自由基清除率和還原力呈現發酵前75 d逐漸上升達到峰值、75 d后略有下降的趨勢，發酵75 d時的自由基清除率分別為65.06%、59.04%和1.93（OD700nm值）。表明發酵60～75 d時的蘋果酵素的抗氧化活性較好，這可能與此時酵素中總酚、總黃酮含量較高有關系[21]。

圖3 蘋果酵素自然發酵過程中抗氧化能力的變化Fig.3 Changes of antioxidant capacity during natural fermentation process of apple Jiaosu

2.4 蘋果酵素中總酚、總黃酮、SOD活性與抗氧化能力的相關性

酵素發酵技術通過復雜的物質代謝，不僅可以改善果蔬原料原有的一些不良風味，還可以產生一些新的生物活性成分，增加酵素食品的風味、口感及功效，提高產品抗氧化能力[22]，酵素富含的多酚、黃酮以及功效酶等物質能夠有效清除機體內自由基[23]。選擇蘋果酵素自然發酵過程中含量較高的抗氧化成分總酚、總黃酮、SOD活性，分析它們與DPPH自由基清除率、O2-·清除率、·OH清除率、ABTS自由基清除率和還原力之間的相關性，結果見表2。

表2 蘋果酵素中總酚、總黃酮、超氧化物歧化酶活性與抗氧化能力的相關性Table 2 Correlation analysis of total phenols,total flavonoids contents,superoxide dismutase activity and antioxidant capacity of apple Jiaosu

由表2可以看出，總酚含量與DPPH·、O2-·、·OH、ABTS·清除能力及還原力呈顯著正相關（P＜0.05）；SOD活性與DPPH·、·OH、ABTS·清除能力及還原力呈極顯著正相關（P＜0.01），與總酚、總黃酮含量之間相關性較弱（P＞0.05）；而DPPH自由基、·OH以及ABTS自由基清除能力之間呈極顯著正相關（P＜0.01），因此，想要全面評估蘋果酵素的抗氧化能力，應使用多種測定方法體系[24]；總黃酮含量與自由基清除能力及還原力之間無顯著相關性，這可能是由于蘋果酵素中總黃酮含量較低的原因，有待于進一步研究。說明蘋果酵素抗氧化能力的主要來源是SOD活性。

3 結論

通過對蘋果酵素自然發酵過程中抗氧化成分（總酚、總黃酮、VC、總花青素含量）、功效酶活性（SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及抗氧化能力（DPPH·、O2·、·OH、ABTS·清除能力和還原力）的變化進行研究，結果表明，蘋果酵素自然發酵過程中，除VC、總花青素含量分別基本保持穩定以外，其他抗氧化成分、功效酶活性以及抗氧化能力總體呈先升高再趨于穩定或略有下降的趨勢。總酚和總黃酮含量在發酵60 d時達到最高，分別為1.16mg/mL和0.45 mg/mL；SOD、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的活性在發酵90d時達到最高（42.12U/mL、23.34U/mL、10.03 U/mL、6.15 U/mL和2.14 U/mL）；DPPH·、、·OH、ABTS·清除能力和還原力在發酵60～75 d時抗氧化活性最高（85.29%、78.85%、65.06%、59.04%和1.93）。同時，總酚含量與DPPH·、、·OH、ABTS·清除能力及還原力呈顯著正相關（P＜0.05）；SOD活性與DPPH·、·OH、ABTS·清除能力及還原力呈極顯著正相關（P＜0.01），說明SOD活性是蘋果酵素抗氧化能力的主要來源。