純培養微生物熒光原位雜交技術檢測的影響因素探究

吳冬梅，薛正楷，2，周榮清

（1.瀘州職業技術學院郎酒學院，四川瀘州 646000；2.瀘州市生物醫學工程研究所，四川瀘州 646000；3.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610065）

熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）是利用熒光標記已知序列的核酸堿基（探針），根據堿基互補配對原則，探針與待測樣本中目標核酸進行特異性結合，形成待測核酸與標記探針的雜交體，通過熒光激發產生熒光信號。該技術廣泛應用于細胞遺傳學[1-2]、腫瘤生物學[3-4]、微生物群落研究等領域。在環境微生物群落研究中，FISH技術用于診斷海水、湖泊[5]沉積物中的微生物，河水、溪流[6]和海洋[7]中的菌體微生物，土壤[8]和根系表面[9]的寄居群落等環境微生物；該技術還應用于研究除磷細菌、硝化細菌及厭氧氨氧化菌等環境工程微生物。杜照中[10]用FISH技術檢測文登鹽場沉積物樣品，觀察到了慢生單胞菌的細胞類群，然因數量較少，未能明確計數。姚倩[11]采用熒光原位雜交技術對十個城市污水處理系統的脫氮性能及硝化菌的種群結構進行檢測，結果表明活性污泥中亞硝酸鹽氧化細菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）的數量明顯高于氨氧化細菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）的數量。樊香妮[12]在研究溫度對強化生物除磷（enhanced biological phosphorus removal，EBPR）系統處理性能及種群關系的影響時，采用FISH方法對活性污泥中主要功能微生物（聚磷菌和聚糖菌）的相對數量及分布狀態進行分析，結果表明隨著溫度的升高，活性污泥中聚磷菌（polyphosphate accumulating organisms，PAOs）的比例下降，而聚糖菌（glycogen accumulating organisms，GAOs）的比例顯著增加，當30 ℃時，PAOs占總細菌的比例僅為8%左右，而GAOs的比例高達（82±3）%。OEHMENA A等[13]使用該技術研究了序批式反應器（sequencing batch reactor，SBR）中反硝化聚磷菌（denitrifying phosphorus removing bacteria，DPB）及其競爭菌在污泥中的分布及群落形態，結果表明，除磷效果好時反硝化聚磷菌占優勢，除磷效果壞時競爭菌占優勢。SOEJIMA K等[14]采用FISH技術研究反A2/O反應器中聚磷菌的結果表明，加入亞硝酸鹽后聚磷菌數量降低，除磷能力下降，反硝化菌菌量越多越利于脫氮除磷過程。如MOLLER S等[15]研究了生物膜中微生物的空間分布、啟動子誘導及其表達的時序進程，同時對不同種類菌體間的相互作用及影響進行了分析；SCHRAMM A等[16]將微傳感器和FISH技術結合，剖析了微生物群落結構和代謝活性，揭示了厭氧微生物在有氧環境中的缺氧微生態位。但在眾多研究中發現[17-19]，FISH雖然實現了可視化（待測樣本中目標核酸與帶有熒光物質的探針接合，熒光激發產生熒光信號，用熒光顯微鏡即可直接觀察菌體位置），但不同的檢測對象可視化程度差異較大，有的樣品中菌體可視化程度超過90%，而有的樣品可視化程度不到50%。本實驗擬以純培養革蘭氏陰性細菌大腸桿菌及革蘭氏陽性細菌植物乳桿菌為研究對象，探究純培養微生物FISH檢測的菌體種類、菌體生長時期、菌體分散方式、細胞通透性、雜交條件等影響因素，以期為白酒生產過程中酒曲表層、中層、中心，窖池不同發酵部位（上、中、下層四角、中心）糟醅，窖池不同部位（窖底、窖壁）窖泥中各種釀酒微生物的原位雜交檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：四川省微生物資源保藏中心；植物乳桿菌（Lactobacillus planetarium）滬1.08：上海市釀造科學研究所。

1.1.2 化學試劑

多聚賴氨酸（分子質量＞15 000 Da）、焦碳酸二乙酯（分析純）：美國Sigma公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（分析純）：美國Roche公司；甲酰胺、多聚甲醛（均為分析純）：成都科龍化工有限公司；氨丙基三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysilane，APES）（分析純）：北京中杉金橋生物技術有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium lauryl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（tromethamine，Tris）、焦磷酸鈉（分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；抗熒光猝滅封片液：海門碧云天生物技術有限公司；溶菌酶（＞20 000 U/mg）；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：天津市津北精細化工有限公司；丙酮（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉膏10.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，檸檬酸二銨2.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO4·H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

BX-51熒光顯微鏡、CX31RTSF光學顯微鏡：日本奧林巴斯公司；PHS-3C型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；TGL16M高速離心機：湘麓離心機儀器有限公司；722型可見分光光度計：上海棱光儀器有限公司；KQ-100E超聲波清洗器：蘇州江東精密儀器有限公司；GL-20G-C型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養箱：上海一恒實驗儀器有限公司；QYC-2112型恒溫振動培養器：上海?，攲嶒炘O備有限公司；YX-450全自動不銹鋼雙層立式電熱壓力蒸汽消毒器：上海三申醫療器械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株生長曲線的測定

E.coli：將（37±1）℃、150 r/min條件下振蕩培養8 h活化的E.coli以2%接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基，混勻后于（37±1）℃、150 r/min條件下振蕩培養，分別用顯微鏡直接計數0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h的菌體數量，繪制菌體生長曲線。

L.planetarium：將（30±1）℃條件下靜置培養12 h活化的L.planetarium以2%接種量接種到MRS液體培養基，混勻后在（30±1）℃條件下靜置培養，分別用顯微鏡計數0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h、52 h、56 h、60 h、64 h、68 h、72 h的菌體數量，繪制菌體生長曲線。

1.3.2 菌體細胞形態觀察及細胞計數

對2種不同生長時期菌體進行簡單染色（齊氏石碳酸復紅染色液）、觀察菌體形態；對菌體進行FISH計數（FISH counting，FISHC）和顯微鏡直接計數（direct microscopic count，DMC），計算FISHC/DMC值。

1.3.3 FISH檢測方法

取培養至穩定期的菌液5 mL，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.2）25 mL，渦旋混勻，10 000 r/min高速冷凍離心10 min，收集菌體，重復洗滌1次后收集菌體，進行熒光原位雜交檢測[20]。

1.3.4 純菌株FISH檢測條件優化

（1）菌體分散方式的選擇

穩定期的菌體用多聚甲醛固定，探討菌體不同分散方式。方式1：玻珠（Φ：3～5 mm）搖床振蕩打散60 min，轉速150r/min；方式2：渦旋振蕩后超聲波處理，超聲功率為100W，超聲時間分別為：0 s、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，間隔30 s超停一次。原位雜交后鏡檢觀察FISH檢測效果。

（2）細胞通透性對FISH檢測的影響

以L.planetarium和E.coli為研究對象，使用溶菌酶在37 ℃條件下分別對穩定期菌體處理0 min、30 min、60 min、90 min（10 mg/mL溶菌酶1 mL）后進行原位雜交，FISH計數（FISHC）；同時顯微鏡直接計數菌液菌體數目；計算菌體檢出率（FISHC/DMC）。

（3）雜交條件的優化

針對雜交條件（雜交時間、雜交溫度、甲酰胺濃度及洗脫液中NaCl濃度）固定某3個因素，改變另外一個因素進行實驗。原位雜交后FISH計數（FISHC）。雜交時間分別為1h、2 h、3 h，雜交溫度分別為38 ℃、42 ℃、46℃，甲酰胺濃度分別為10%、20%、30%，洗脫液中NaCl濃度分別為100 mmol/L、300 mmol/L、500 mmol/L。同時對菌液顯微鏡直接計數（DMC），計算菌體檢出率（FISHC/DMC）。

1.3.5 數據處理

FISH 3.0分析軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 菌體細胞生長曲線測定、形態觀察及菌體計數

2.1.1 純培養菌體生長曲線

由圖1A可知，E.coli菌體適應新環境能力強，幾乎不經延滯期就直接進入對數生長期；且菌體生長速度較快，8 h后進入穩定期，此后菌體數目幾乎無明顯變化；16 h后隨著營養物質的耗盡和菌體死亡量增加，菌體量減少，E.coli菌體生長進入衰退期。由圖1B可知，L.planetarium經4 h延滯期適應新環境后，在營養物質充沛的條件下，菌體迅速增殖進入對數生長期，約在20 h時開始進入穩定期；約52 h后，菌體死亡量增加，菌體進入衰退期。

圖1 大腸桿菌（A）和植物乳桿菌（B）的生長曲線Fig.1 Growth curves of Escherichia coli (A) and Lactobacillus planetarium (B)

2.1.2 不同生長時期菌體形態觀察

不同生長時期E.coli和L.planetarium菌體形態觀察結果見圖2和圖3。

由圖2可知，不同生長時期的E.coli菌體形態規則，呈單個短桿狀，菌體間比較分散且無連接，是革蘭氏陰性菌（G-）。由圖3可知，對數生長期的L.planetarium呈鏈狀，菌體長短不一，每節菌體形態規則，呈桿狀，長度較均一；進入穩定期后，菌體為二聯菌體，形態規則，呈短桿狀，二聯體的兩節菌體間或成一定角度或處于同一直線，菌體分散；衰退期的L.planetarium亦主要以二聯體為主，菌體分散、菌體形態不太規則，是革蘭氏陽性菌（G+）。

圖2 大腸桿菌不同生長期的形態（100×）Fig.2 Cell morphology of E.coli in different growth phases (100×)

圖3 植物乳桿菌不同生長期的形態（100×）Fig.3 Cell morphology of L.planetarium in different phases (100×)

2.1.3 不同生長時期菌體計數結果

菌體純培養物E.coli（G-）和L.planetarium（G+）在對數、穩定和衰減期的FISHC/DMC比值結果見圖4。由圖4可知，總體而言，革蘭氏陰性菌（E.coli）檢出率較革蘭氏陽性菌（L.planetarium）高，因為前者細胞壁較薄，探針容易進入；在同一菌體的不同生長時期，隨著培養時間增加，菌體檢出率呈現降低趨勢，可能是越到培養后期，菌體rRNA含量及活性有所降低。綜上，菌體種類及生理狀態對FISH法的定量表征有一定影響，尤其是對衰退期的革蘭氏陽性菌影響較明顯。

圖4 兩種菌體不同生長時期的熒光原位雜交技術計數與顯微鏡直接計數比值Fig.4 Ratio of FISH count/direct microscopic count of two strains at different growth stages

2.2 FISH條件的優化

2.2.1 菌體分散方式的選擇

采用玻珠或超聲波處理待雜交菌體分散液，菌體分散狀況見圖5。經玻珠搖床振蕩（150 r/min）處理60 min的樣品如圖5A所示，菌體分散程度良好；由圖5B～5F可知，未經超聲波處理的樣品，部分菌體聚集，熒光信號強烈，但不便計數；超聲處理時間為60 s時，菌體分散狀態良好，便于計數；超聲處理時間偏長，菌體活性降低甚至使菌體死亡[21]，熒光信號減弱。因此選擇超聲處理時間為60 s，間隔30 s。

圖5 不同處理方式下大腸桿菌菌體分布情況Fig.5 Distribution situation of E.coli under different processing modes

2.2.2 溶菌酶處理

FISH法檢測菌體細胞時，改變細胞通透性尤為必要，可增大探針與目標核酸結合的幾率，提高菌體檢出率。PERNTHALE A等[19]報道了通過改變靶細胞的通透性使得菌體細胞檢出率從46%提高到了86%；FILION G等[22]也提到使用不同的化學物質及酶處理菌體，改變菌體通透性，以利于FISH檢測。

用溶菌酶處理E.coli和L.planetarium，結果見圖6。由圖6A可知，溶菌酶處理后，菌體檢出率均有較明顯提高，尤其是L.planetarium，效果顯著，檢出率由32.79%提高到70.3%；相同條件下L.planetarium的菌體檢測率略低于E.coli，可能是由于前者是革蘭氏陽性菌，肽聚糖豐富，細胞壁較厚的細胞結構所致；當溶菌酶處理時間為60 min以上時，菌體檢出率達到90%。因此，確定溶菌酶處理時間為60 min。由圖6B可知，時間對菌體檢出率無顯著影響，菌體檢出率都較高（＞88%）。雖然史俊[23]認為雜交時間有較大的影響，過短使雜交不完全，過長則會增加非特異性雜交，但可能受本實驗條件影響，該因素的影響不明顯。本研究選定雜交時間為2 h。

圖6 溶菌酶處理時間（A）及雜交時間（B）與菌體檢出率的關系Fig.6 Relationship between lysozyme treatment time (A),hybridization time (B) and bacterial detection rate

2.2.3 雜交溫度、甲酰胺及NaCl濃度的影響

雜交條件對其雜交體的穩定性有較大的影響，其中雜交溫度、甲酰胺濃度及鹽濃度是對其影響的主要因素。當雜交溫度過低或鹽離子濃度較高及甲酰胺濃度偏低，探針與70%～90%同源順序的核酸雜交而產生非特異雜交信號[24-25]，故可以借雜交后的洗滌過程加以彌補，探針雜交時產生的背景染色特別高時則通過不同鹽濃度清洗液的洗滌，以減少探針與標本間的靜電作用，降低背景獲得較好的對比效果。與寡核苷酸雜交時，其雜交溫度應高于60 ℃，然而卻對菌體形態的完整及在載玻片上粘附造成不良影響。通常，采用在反應體系中加甲酰胺以降低雜交溫度，其濃度每增加1%，RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA體系中的Tm值就分別降低0.35 ℃，0.50 ℃及0.65 ℃[27]。雜交溫度、甲酰胺及NaCl濃度對菌體檢出率影響見圖7。由圖7A和7B可知，雜交溫度和甲酰胺濃度對E.coli檢出率影響不大，而對L.planetarium的檢出率有一定影響，綜合考慮確定雜交溫度為42 ℃、甲酰胺含量為20%，此時兩種菌體檢出率均相對較高（＞90%）。由圖7C可知，洗脫液中鹽濃度在100～300 mmol/L時，純培養物E.coli及L.planetarium的菌體檢出率都較高（＞89%），且背景均無明顯差異，確定NaCl濃度為300 mmol/L。

圖7 雜交溫度（A）、甲酰胺濃度（B）及NaCl濃度（C）與菌體檢出率的關系Fig.7 Relationship between hybridization temperature (A),formamide concentration (B),NaCl concentration (C) and bacteria detection rate

3 結論

本實驗以E.coli及L.planetarium為研究對象，研究了不同種屬、不同生長期菌株、預處理方式及雜交條件對基于探針EUB338的FISH檢測結果的影響。結果表明，菌體種類及菌體生長階段均較明顯影響FISH計數的準確性；確定超聲分散菌體時間60 s（100 W、每30 s間歇）、溶菌酶處理60 min可較大幅度提高FISH對菌體的檢出率；確定較優條件為雜交時間2 h、雜交溫度42 ℃、雜交液中甲酰胺含量20%及洗脫液中NaCl濃度300 mmol/L。