山西老陳醋中優良酵母菌株篩選及其在木棗果酒發酵中的應用

邢曉瑩，劉 毅，霍乃蕊，武曉英*

（1.太原師范學院生物系，山西太原 030619；2.山西農業大學園藝學院（山西省農科院園藝研究所），山西晉中 030031；3.山西農業大學動物科技學院，山西晉中 030801）

棗（Ziziphus jujubaMill.）為鼠李科棗屬植物[1]，落葉灌木或小喬木，原產于中國，已有3 000多年的栽培歷史[2]。木棗為棗的一個品種，主要分布于陜晉黃河沿岸的夾谷地帶[3]。其中，呂梁地區是我省木棗的主要栽培區，種植面積約13.33×104hm2，占全省紅棗種植面積的40%；年產量約3×108kg，約占全省紅棗產量的60%[4]。棗果實不僅味道甘甜、營養豐富，同時也是補中益氣、養血安神的常用中藥，其果實中除了含有較多的礦元素和多種維生素外，還含有豐富的氨基酸、黃酮類化合物、酚類化合物、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、多糖類（水溶性的中性多糖、酸性多糖）等功能性物質，具有清除自由基、延緩衰老的功效，提高機體細胞的免疫活性和抗補體等生理活性。

果酒是以新鮮水果（葡萄、蘋果、梨、山楂、柿子等）或果品加工下腳料為主要原料，利用微生物發酵技術釀制的一種營養豐富、風味優良的酒精飲料，酒精度通常在15%vol以下[5]。果酒不僅保留了各類水果中原有的營養成分，在發酵過程中還能生成多種新的功能性成分（如阿洛糖、阿洛酮糖等）[6-10]，兼具營養和保健功能。與白酒和啤酒相比，果酒的果香濃郁、色澤鮮艷，消費市場前景廣闊。呂梁的木棗在豐收之年，常會面臨著產品滯銷、銷售價格低、入不敷出等問題，大量的木棗甚至無人采摘而爛在了地里，嚴重影響了棗農種植、管理木棗的積極性。木棗鮮果中的含糖量在40%以上，干果中的含糖量達85%左右[11]，如能將其釀制成果酒或果醋，不僅能充分利用木棗資源，解決果品產能過剩、損傷及殘次果滯銷等問題，還能提高水果附加值及利用率，增加農民收入，輻射周邊經濟發展及提高企業收入，均具有重要意義。

山西老陳醋是我國傳統的谷物釀造醋，其發酵過程中含有豐富的微生物資源，主要釀造微生物除醋酸菌外，還有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等。參與發酵的釀造微生物經過長期的高溫、高酒精度和高酸馴化，分離得到功能菌種，具有耐受性好、致病率低等特點。基于此，本研究采用風味導向的方法，從山西老陳醋酒醪中篩選產酯能力強的功能酵母菌，結合形態觀察、生理生化試驗及26S rDNA基因序列分析技術對菌株進行鑒定。通過研究目標菌株的生物學特性（環境耐受性）及其在棗果酒發酵過程中的實際產酯效果，探究該菌株的商業價值，為棗酒的純種發酵或強化發酵提供優質的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料及菌株

酒醪（發酵3 d、5 d、15 d的酒醪）：山西老陳醋集團有限公司；安琪生香活性干酵母（多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha））Y24、安琪果酒專用酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；木棗：產自呂梁地區。

1.1.2 培養基

孟加拉紅篩選培養基[12]：蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，瓊脂1.5%，孟加拉紅0.003 3%，氯霉素0.01%，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

產酯發酵液[13]：葡萄糖8%，酵母膏1%，蛋白胨2%，pH 4.5±0.2，121 ℃滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基[13]：蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母浸粉1%，pH 6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min。固體培養基中添加1.5%的瓊脂粉。

麥芽汁液體培養基[14]：氯霉素0.01%，麥芽膏粉13%，pH 6.0±0.2，121 ℃滅菌15 min。固體培養基中添加1.5%的瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；孟加拉紅培養基、氫氧化鈉、無水葡萄糖、濃鹽酸、氯化鈉、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂、無水乙醇、偏重亞硫酸鉀、抗壞血酸：北京索萊寶科技有限公司；LALLZYME HC果膠酶（20 000 U/g）：法國LAFFORT公司；所用試劑均為生化試劑或分析純。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-1ND型無菌超凈工作臺：北京東聯哈爾濱儀器設備有限公司；LS-35LJ型立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫療設備有限公司；ZQPL-200型立式恒溫振蕩培養箱：天津萊玻特瑞設備有限公司；DyNA-Quant-200型熒光計：通用電氣醫療集團生命科學部；UVP凝膠成像系統：上海書俊儀器設備有限公司；5424R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；7500聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；CX41型生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離

參照文獻[15]采用傳統純培養方法進行分離。

1.3.2 產酯酵母菌的篩選

將保存在斜面上的菌株接種于YPD液體培養基中，28℃、130 r/min條件下活化培養24 h。按2%接種量將活化后的菌株（107CFU/mL）接種于產酯發酵液中，28 ℃靜置培養7 d，按國標GB 19777—2005《原產地域產品山西老陳醋》附錄C中的方法測定發酵液中的總酯含量[16]，試驗重復3次。

1.3.3 產酯酵母菌的鑒定

形態觀察：將篩選菌株劃線接種于麥芽汁瓊脂培養基，28 ℃培養48 h，觀察單菌落特征，記錄菌落的形狀大小、菌落顏色、表面情況（粗糙或光滑、有無光澤）、隆起程度、邊緣情況等[14]。將篩選菌株接種于麥芽汁液體培養基中，28 ℃培養3 d，通過光學顯微鏡觀測其細胞形態（大小、形狀、菌絲等，×400倍）[17]。

生理生化試驗[18-19]：對其進行糖發酵試驗、碳源同化試驗和氮源同化試驗。

分子生物學鑒定[20]：采用酵母基因組DNA抽提試劑盒提取篩選菌株的基因組，以其為模板，采用引物NL1和NL4對菌株的26S rDNA D1/D2區域基因序列進行PCR擴增，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠檢測合格后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）檢索，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2基因序列，采用MEGA 7.0生物學軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，自展值1 000。

1.3.4 產酯酵母的環境耐受性分析[21-22]

以YPD液體培養基為基礎，按2%接種量將活化后的菌液（107CFU/mL）接種于相應培養基中，28 ℃培養3 d，采用紫外分光光度計測定發酵液在波長600 nm處的吸光度值。依次考察產酯酵母對乙醇體積分數（0、6%、8%、10%和12%）、培養溫度（30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃）、pH（4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0）、糖度（10°Bx、15°Bx、20°Bx、25°Bx、30°Bx、35°Bx）及SO2添加量（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L）的耐受能力。

1.3.5 木棗果酒釀造工藝

操作要點：稱取無病蟲害的、去核后的木棗5 kg，加入木棗質量3倍的水以及0.01%的偏重亞硫酸鉀和0.1%的抗壞血酸組成的復合護色液打漿，80 ℃熱處理10 min。冷卻至室溫后轉入20 L的發酵罐中，加入果膠酶，酶制劑用量為果漿質量的0.01%，攪拌均勻，在25～30 ℃的條件下靜置8～10 h。將蔗糖熔化成的糖漿煮沸殺菌后加入果漿中，調整初始糖度為15°Bx。先接種產酯酵母有氧發酵24 h，再接種安琪果酒專用酵母有氧發酵24 h，之后封口發酵7 d。發酵結束的果酒上清液經0.22 μm的濾芯除菌過濾，在60～70 ℃條件下加熱15～20 min進行巴氏殺菌，最后靜置陳釀一段時間，經檢驗合格進行無菌灌裝，得到木棗果酒樣品。

1.3.6 木棗果酒釀造工藝優化

（1）單因素試驗

以總酯含量作為主要評價指標，固定基本條件為料液比1∶3（g∶mL），初始發酵糖度調整至15°Bx，順序接種6%的產酯酵母和0.5%安琪果酒專用酵母，28 ℃酒精發酵7 d。每天取樣檢測發酵液的糖度、酒精含量和總酯含量。在此基礎上，采用單因素輪換法，分別考察并確定出料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL））、發酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、產酯酵母接種量（2%、4%、6%、8%、10%）和發酵時間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）這4個因素的最佳水平。

（2）響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇料液比（A）、產酯酵母接種量（B）和發酵溫度（C）3個影響較大的因素為自變量，以發酵結束時的酒精度（Y1）和總酯含量（Y2）為響應值，利用軟件Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken試驗設計3因素3水平的響應面試驗，因素與水平見表1。

表1 木棗果酒發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of jujube fruit wine

1.3.7 酒精度的測定

采用蒸餾法[22]測定酒精度。

1.3.8 風味及口感的測定

選10名食品專業人員參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[23]，分別對木棗果酒產品的風味及口感進行感官評價。

1.3.9 數據處理

采用MEGA 7.0生物學軟件和Design Expert 8.0.6軟件進行試驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離

從孟加拉紅篩選培養基上挑取具有明顯酵母菌形態特征的菌落，經純化后初步篩選出23株酵母，編號為Y1～Y23。

2.2 產酯酵母菌的篩選

以安琪生香活性干酵母Y24為對照，測定23株產酯酵母菌株的產酯能力，結果見圖1。由圖1可知，與對照菌株Y24相比，菌株Y2、Y5、Y8、Y14和Y18產酯能力較強。其中，菌株Y14的產酯能力最強，為（38.52±0.19）g/L，其次是菌株Y18[（36.04±0.28）g/L]和Y5[（35.32±0.32）g/L]。因此，選擇菌株Y14為目標菌株。

圖1 24株酵母菌株的總酯產量Fig.1 Total ester production of 24 yeast strains

2.3 產酯酵母菌株Y14的鑒定

2.3.1 形態觀察結果

菌株Y14的菌落及細胞形態見圖2。由圖2可知，菌株Y14在麥芽汁瓊脂培養基上培養24 h，菌落呈圓形，淺白灰色，表面平滑，不反光，邊緣整齊。在麥芽汁液體培養基中28 ℃培養3 d，細胞大小為（4.6～6.5）×（3.8～6.5）μm，呈卵形、球形，不產生假菌絲。

圖2 菌株Y14的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.2 Colony (a) and cell (b) microphotographs of strain Y14

2.3.2 生理生化試驗結果

菌株Y14的生理生化試驗結果見表2。由表2可知，菌株Y14可以發酵或同化利用葡萄糖、D-甘露醇、琥珀酸、乳酸、甘油和KNO3，不能發酵或同化利用L-鼠李糖、可溶性淀粉、檸檬酸、肌醇、核糖醇和纖維二糖等。根據酵母菌的形態特征與生理生化特征，參照文獻[19，24]，初步鑒定菌株Y14為畢赤酵母屬（Pichiasp.）。

表2 菌株Y14的生理生化試驗結果Table 2 Results of physiological and biochemical tests of strain Y14

2.3.3 26S rDNA Dl/D2序列分析結果

菌株Y14的系統發育樹見圖3。由圖3可知，菌株Y14與毛榛畢赤酵母（Pichia manshurica）聚于一支，親緣關系最近。結合形態觀察、生理生化試驗結果，鑒定菌株Y14為毛榛畢赤酵母（Pichia manshurica）。現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（china general microbiological culture collection center，CGMCC），編號為2.5274。

圖3 基于26S rDNA基因序列菌株Y14的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Y14 based on 26S rDNA gene sequence

2.4 毛榛畢赤酵母Y14的環境耐受性分析

2.4.1 乙醇耐受性試驗

乙醇是酵母菌的主要代謝產物，是酒精發酵階段最重要的物質之一。發酵液中乙醇含量的積累也會對參與發酵的微生物產生一定的抑制和毒害作用，菌株的乙醇耐受力與乙醇產率密切相關，可以將其作為篩選高產乙醇酵母的一個參考依據[25]。菌株Y14對乙醇的耐受性見圖4。由圖4可知，隨著乙醇體積分數的增大，菌株Y14的生長逐漸受到抑制。當乙醇體積分數在0～6%之間時，OD600nm值呈緩慢下降趨勢，此時的乙醇體積分數對菌株Y14的正常生長影響較小；當乙醇體積分數達到8%時，OD600nm值降為0.68，表明菌株Y14的生長受到抑制，生長較緩慢；當乙醇體積分數＞8%后，OD600nm值迅速降低，菌株Y14的生長受到嚴重抑制，基本不生長。因此，確定菌株Y14的最高耐受乙醇體積分數為8%。

圖4 菌株Y14對乙醇的耐受性Fig.4 Ethanol tolerance of strain Y14

2.4.2 pH耐受性試驗

山西老陳醋是我國傳統的谷物釀造醋，是自然富集的多菌種共同發酵的過程，含有豐富的微生物資源[26]。隨著酒化時間的延長，酒醪的pH值逐漸降低，至發酵結束時，pH值由發酵初期的3.92降至3.22，這就要求參與發酵的微生物，必須具有一定的耐酸性。菌株Y14的pH耐受性試驗結果見圖5。

圖5 菌株Y14的pH耐受性Fig.5 pH tolerance of strain Y14

由圖5可知，隨著pH值的降低，菌株Y14的生物量呈先升高后降低的趨勢，適宜菌株Y14生長的最佳pH值為3.5。當pH值在3.5～4.5之間時，OD600nm值呈逐漸上升趨勢，且在pH 3.5時達到峰值（OD600nm值1.08），表明該pH值范圍適合菌體的生長；當pH值在2.5～3.5之間時，OD600nm值開始降低，表明菌株Y14的生長受到抑制，生長較緩慢；當pH值在2.0～2.5之間時，OD600nm值迅速降低，菌株Y14的生長受到嚴重抑制，基本不生長。因此，確定菌株Y14的最佳培養pH值為3.5，可以耐受的pH值為2.5～4.5。

2.4.3 溫度耐受性試驗

酵母菌生長溫度在20～40 ℃之間，是典型的嗜溫型生物[27]。菌株Y14的溫度耐受性結果見圖6。由圖6可知，當溫度在28～30 ℃時，菌株Y14的OD600nm值基本保持平穩，該溫度區間適合菌株Y14的生長繁殖；當溫度在30～39 ℃時，OD600nm值呈持續下降趨勢，表明菌株Y14的生長受到了影響，菌株的繁殖能力隨溫度的升高明顯減弱；當溫度超過42 ℃后，菌體的生長繁殖基本停止，推測可能是高溫破壞酵母細胞膜，造成細胞損傷，影響細胞生長和代謝[28-29]。因此，確定菌株Y14的最高耐受溫度為39 ℃。

圖6 菌株Y14對溫度的耐受性Fig.6 Temperature tolerance of strain Y14

2.4.4 糖度耐受性試驗

水果中的糖以葡萄糖、果糖、蔗糖為主，酵母菌可利用這些糖類供自身生長繁殖，同時進行酒精發酵產生乙醇[5]。在一定范圍內，酵母的發酵能力隨著糖濃度的增大而增強。但是，過高濃度的糖會對酵母菌的生長產生抑制作用，同時，高滲透壓也會造成酵母細胞的水分流失，致使其活性降低[29]。菌株Y14的糖度耐受性結果見圖7。由圖7可知，隨著葡萄糖含量的升高，菌株Y14生物量先升高后降低，當發酵液的糖度＜30°Bx時，不會對其產生負影響，說明菌株Y14對葡萄糖的耐受性較好。果酒酒精發酵時的初始糖濃度一般＜25°Bx（按葡萄糖計）[30-32]，而山西老陳醋糖化階段的還原糖含量通常＜20°Bx[12]，菌株Y14能夠發揮正常功能。因此，菌株Y14的最適發酵糖度為30°Bx，可以耐受35°Bx的糖度。

圖7 菌株Y14對糖的耐受性Fig.7 Glucose tolerance of strain Y14

2.4.5 SO2耐受性試驗

果酒發酵前期通常需加入適量的SO2，達到防止雜菌污染、抗氧化以及護色等目的，但較高濃度的SO2對發酵主體微生物也有一定的抑制作用[33]。菌株Y14對SO2的耐受性見圖8。由圖8可知，菌株Y14的生長隨著SO2質量濃度的升高逐漸受到不同程度的抑制。目標菌株在含有0～150 mg/L SO2的培養液中生長24 h后，OD600nm值略有下降，表明菌株Y14的生長繁殖基本不受影響；當SO2質量濃度為150～250 mg/L時，OD600nm值迅速降低，表明其生長受到較大程度的抑制；當SO2質量濃度＞250 mg/L之后，生物量基本為0，表明其生長受到嚴重抑制。果酒發酵初期，為抑制或殺死其他雜菌，保證發酵的正常進行，通常會添加60～100 mg/L的SO2[34]，菌株Y14在這個范圍內基本不受影響，能夠正常發揮其生理功能。因此，菌株Y14最高可以耐受質量濃度為200 mg/L的SO2。

圖8 菌株Y14對SO2的耐受性Fig.8 SO2tolerance of strain Y14

2.5 毛榛畢赤酵母Y14在木棗果酒中的應用

2.5.1 料液比對木棗果酒發酵的影響

以總酯含量為主要評價指標，料液比對木棗果酒發酵的影響見表3。由表3可知，不同的料液比對木棗果酒酒精度、總酯含量及風味、口感的影響顯著（P＜0.05）。當料液比為1∶2（g∶mL）時，木棗果酒的酒精度最高，達11.2%vol，總酯含量為（1.22±0.01）g/100 mL，發酵液果香濃郁，口感偏苦澀；當料液比為1∶3（g∶mL）時，木棗果酒的酒精度為（10.6±0.16）%vol，總酯含量最高為（1.64±0.06）g/100 mL，有濃郁的棗香氣和協調的酒香，酒體豐滿，酸甜適口；當料液比為1∶4～1∶6（g∶mL）時，棗汁濃度降低，發酵而成的木棗果酒酒精度在6.8%vol～8.8%vol之間，總酯含量在（0.46～1.48）g/100mL之間，棗香、酒香較淡，酒質較粗糙。因此，確定最適料液比為1∶3（g∶mL）。

表3 料液比對木棗果酒發酵的影響Table 3 Effect of material to liquid ratio on jujube fruit wine fermentation

2.5.2 發酵溫度對木棗果酒發酵的影響

以總酯含量為主要評價指標，發酵溫度對木棗果酒發酵的影響見表4。

表4 不同發酵溫度對木棗果酒發酵的影響Table 4 Effect of different fermentation temperature on jujube fruit wine fermentation

低溫更有利于產酯酵母發酵，從而提高果酒品質[35]；但是溫度過低也會影響酵母的繁殖和代謝速度。由表4可知，當發酵溫度為24～26 ℃時，發酵液中的酒精含量偏低，為7.6%vol～8.9%vol，棗香濃郁，酒香較淡，口感偏甜；當發酵溫度為28～32 ℃時，發酵液中的酒精含量為10.8%vol～11.2%vol，總酯含量為（1.42～1.68）g/100 mL，果香、酒香愉悅和諧，滋味可口，無苦味。26～28 ℃發酵條件下的總酯含量明顯高于32 ℃發酵溫度下的，推測可能是略低的發酵溫度適合酯類物質的生成，當發酵溫度高于28 ℃會導致產酯酵母的產酶活力降低，不利于產酯酵母代謝，果酒品質也相應降低[35-36]。因此，確定最適發酵溫度為28 ℃。

2.5.3 毛榛畢赤酵母Y14接種量對木棗果酒發酵的影響

以總酯含量為主要評價指標，毛榛畢赤酵母Y14接種量對木棗果酒發酵的影響見表5。

表5 不同毛榛畢赤酵母Y14接種量對木棗果酒發酵的影響Table 5 Effect of different Pichia manshurica inoculum on jujube fruit wine fermentation

由表5可知，P.manshuricaY14接種量過低，發酵啟動慢，24 h后接種的安琪果酒專用酵母快速繁殖成為優勢菌，會對P.manshuricaY14的生長繁殖產生競爭性的抑制作用，發酵液中也會積累大量的酒精，抑制了P.manshuricaY14的繁殖及代謝，不利于提高發酵液中的總酯含量。當P.manshuricaY14接種量為6%～8%時，木棗果酒的酒精度為10.0%vol～10.2%vol，總酯含量為（1.64～1.68）g/100 mL，果香、酒香愉悅和諧，口感較好。繼續加大P.manshuricaY14的接種量，一方面酵母快速繁殖消耗了大量的營養物質，酒體含糖量降低；另一方面可能會導致發酵液中溶氧不足，進而對酵母菌的生長繁殖產生抑制作用，不利于香氣物質的形成，導致口感變差。因此，確定最適P.manshuricaY14的接種量為6%。

2.5.4 發酵時間對木棗果酒發酵的影響

以總酯含量為主要評價指標，發酵時間對木棗果酒發酵的影響見表6。

表6 不同發酵時間對木棗果酒發酵的影響Table 6 Effect of different fermentation time on jujube fruit wine fermentation

由表6可知，不同發酵時間對木棗果酒酒精度的影響不大。當發酵時間為5～6 d時，木棗果酒中的果香和酒香較淡，酒味略重，口感較差，推測可能是果酒中的酯類、有機酸、多糖、氨基酸等風味物質尚未完全生成，發酵不徹底所致[37]；當發酵時間為7 d時，木棗果酒中的總酯含量為1.62 g/100 mL，果香和酒香逐漸協調一致，酒體豐滿，酸甜可口，同時果酒的酒度達到最大值11.0%vol；隨著發酵時間的繼續延長（9 d），木棗果酒的酒精度略有所降低，此時應結束發酵。因此，確定最適發酵時間為7 d。同時，考慮到發酵時間對木棗果酒酒精度的影響并不明顯，故而在響應面試驗中發酵時間不作為考察因子進行考慮。

2.5.5 木棗果酒發酵工藝優化響應面試驗

（1）回歸模型的建立及方差分析

響應面試驗設計及結果見表7，方差分析見表8。

采用軟件Design-Expert 8.0.6對表7的數據進行回歸擬合，得到二次回歸方程為：

由表8回歸方程的方差分析結果可知，兩個模型均極顯著（P＜0.01），且失擬項均不顯著（P=0.29/0.055＞0.05），說明此兩個模型是可靠的；變異系數（coefficient of variation，CV）=2.09%/9.38%，較小，說明試驗操作可信；酒精度和總酯含量的校正決定系數R2Adj=0.948 5/0.900 0，表明94.85%/90.00%的響應值變化是由所選變量引起的，決定系數R2=0.977 5/0.956 2與R2Adj較接近，說明模型擬合程度較好，誤差較小，采用響應曲面法優化建立的木棗果酒發酵工藝回歸方程（模型）是有效的。

表7 木棗果酒發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 7 Design and results of response surface experiments for jujube fruit wine fermentation process optimization

表8 響應面試驗結果的方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiments results

以酒精度為響應值時，一次項A、B和二次項A2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、AC、BC影響顯著（P＜0.05），由F檢驗可以得到因子貢獻率為A＞B＞C；以總酯含量為響應值時，一次項A、C和二次項A2、B2影響極顯著（P＜0.01），一次項B影響顯著（P＜0.05），由F檢驗可以得到因子貢獻率為A＞C＞B。

（2）響應曲面分析

3個因素對指標影響的響應面結果見圖9。由圖9可直觀地看出料液比、P.manshuricaY14接種量和發酵溫度的交互作用對酒精含量（Y1）和總酯含量（Y2）的影響程度。響應面的陡峭程度，表示兩個因素之間的交互作用是否明顯。在Y1模型中AB、AC、BC交互作用顯著，等高線呈現橢圓形，存在極值，曲面較為陡峭，交互作用顯著；在Y2模型中，AB、AC、BC交互作用不顯著，與表8中的方差分析結果一致。

圖9 料液比、接種量和發酵溫度交互作用對酒精度（a）及總酯含量（b）影響的響應曲面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines for effects of interaction between material-liquid ratio,inoculum and fermentation temperature on alcohol content (a) and total ester content (b)

（3）驗證試驗

以總酯含量為主要評價指標，通過回歸擬合方程2得到的木棗果酒最優發酵條件為料液比1.0∶2.8（g∶mL），毛榛畢赤酵母接種量6.2%，發酵溫度28.3 ℃，預測的總酯含量為1.67 g/100 mL，酒精度為10.8%vol。實際發酵中為操作方便調整為料液比1∶3（g∶mL），順序接種毛榛畢赤酵母Y14 6%、安琪果酒專用酵母0.5%，發酵溫度28 ℃，發酵周期7 d，在優化得出的最佳條件下做3次平行驗證試驗，獲得木棗果酒的總酯含量為（1.68±0.02）g/100 mL，酒精度為（10.5±0.12）%vol，與理論預測值接近。成品果酒的顏色呈琥珀色，棗香、酒香濃郁清新，酒體豐滿醇厚，酸甜可口。因此，經響應面法優化所得的最佳發酵工藝參數準確可靠，模型合理可靠，具有實際應用價值。

3 結論

采用純培養技術從山西老陳醋酒醪中共分離到23株酵母菌，通過產酯性能測試，初篩出1株產酯能力最強的菌株Y14，總酯產量為（38.52±0.19）g/L，通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定其為毛榛畢赤酵母（Pichia manshurica）。菌株Y14的環境耐受性分析結果表明，菌株Y14可在乙醇體積分數8%、pH值2.5～4.5、糖度35 °Bx、SO2200 mg/L和最高溫度不超過39 ℃的環境中生存。將P.manshuricaY14應用于木棗果酒發酵，在單因素試驗的基礎上采用響應面分析，獲得木棗果酒的最適發酵工藝為料液比1∶3（g∶mL），P.manshuricaY14和安琪果酒專用酵母的順序接種量分別為6%和0.5%，發酵溫度28 ℃，周期7 d。制成的木棗果酒酒精度為（10.5±0.12）%vol，總酯含量為（1.68±0.02）g/100 mL，有明顯的棗香氣，濃郁清新，酒體豐滿醇厚，酸甜可口。