鮮食葡萄來源酵母菌的鑒定及其釀造學特性分析

劉曉柱，李銀鳳，張遠林，曾 爽，張 松，黃名正

（貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴州貴陽 550003）

葡萄酒的發酵本質上是酵母菌將葡萄糖轉化為酒精及其他代謝產物的過程[1]。由于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發酵性能強，酒精耐受性高，易于控制[2]，因此生產者多采用商業化的純種S.cerevisiae進行葡萄酒的生產，但酒體的風味特性、典型性以及豐富性通常不如采用非釀酒酵母生產的葡萄酒[3]。因此，隨著人們對非釀酒酵母認識的不斷加深，將各類非釀酒酵母用于酒類的生產逐漸成為一種普遍接受的方法[4-6]。但一般非釀酒酵母對乙醇較為敏感，因此多采用混合接種的方式（包括共同接種、順序接種兩種形式），既保證了發酵的順利進行，又保留了非釀酒酵母的釀造特性[7-9]。

克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）是一種普遍存在于各類水果上非釀酒酵母，某些P.kluyveri在產乙酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸異戊酯等花香和水果香酯類物質方面具有較大的優勢[10]。研究發現，P.kluyveri與S.cerevisiae混合發酵可顯著增加葡萄酒中高級醇和乙基酯的含量[11]；采用P.kluyveri生產的蘋果酒，具有更強的熱帶水果典型風味[12]；LU Y Y等[13]探討了接種P.kluyveri對榴蓮果酒的影響，結果表明，混合接種、順序接種P.kluyveri發酵的榴蓮果酒乙酸乙酯、乙酸異戊酯的含量增加，復合香氣物質更加豐富。除此之外，P.kluyveri與S.cerevisiae混合發酵，還可以顯著提高白蘇維濃中揮發性果香硫醇的含量[14]；P.kluyveri與S.cerevisiae相比，能產生更多的酒精和乳酸乙酯[15]。另外，某些P.kluyveri菌株還能夠分泌一些毒性因子，可抑制葡萄酒生產中一些腐敗酵母[16]。因而，P.kluyveri在葡萄酒生產上具有一定的應用潛能。但與其他類非釀酒酵母相比，目前，對P.kluyveri的研究還比較少，且主要來源于釀酒葡萄品種，對來源于鮮食葡萄來源的P.kluyveri釀造學特性研究更少。

因此，本研究采用形態觀察及分子生物學技術對鮮食葡萄來源菌株YM7進行菌種鑒定，并以商業化S.cerevisiaeX16為對照，從糖發酵性能、生長特性、糖耐受性、酒精耐受性、二氧化硫耐受性、酸耐受性以及β-葡萄糖苷酶、硫化氫生產能力等方面對其釀造學特性進行深入分析；繼而將其與S.cerevisiaeX16混合發酵葡萄汁，分析其對葡萄酒基本理化指標和香氣特性的影響，以期為葡萄酒生產提供潛在的優質酵母菌株，對改善葡萄酒品質特性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌株YM7：分離自陽光玫瑰（Shine Muscat）葡萄，保存于本實驗室；商業化的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）X16：法國LAFFORT公司。

1.1.2 培養基

WL營養瓊脂培養基[17]：酵母浸粉4 g，蛋白胨5 g，葡萄糖50 g，瓊脂20 g，儲存液A（KH2PO413.75 g/L，KCl 10.625 g/L，CaCl23.125 g/L，MgSO4·7H2O 3.125 g/L）40 mL，儲存液B（FeCl32.5 g/L，MnSO42.5 g/L）1 mL，儲存液C（0.44 g溴甲酚綠溶于10 mL無菌蒸餾水和10 mL體積分數95%乙醇中）1 mL，定容至1 000 mL，pH自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基[17]：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。固體培養基另加入20 g瓊脂，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）mix：生工生物工程（上海）股份有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）：上海源葉生物公司；所有試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

UH5300紫外分光光度計：日本日立公司；PHSJ-3F pH儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；SZM體視顯微鏡：中國寧波舜禹儀器有限公司；T100 PCR儀：美國伯樂公司；GCMS-TQ8040 NX氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographmass spectrometer，GC-MS）儀：日本島津儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株YM7的鑒定

形態觀察：將菌株YM7劃線于WL營養瓊脂培養基上，28 ℃倒置培養72 h，記錄菌落顏色、形態、光澤等特征，并拍照。采用結晶紫對菌株YM7進行染色，光學顯微鏡下，觀察細胞形態，并拍照。

分子生物學鑒定：參考HOLM C等[18]方法提取菌株YM7的DNA作為模板，以通用引物NL1和NL4對菌株的26S rDNA D1/D2區域基因序列進行PCR擴增，PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將合格的PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST同源序列搜索比對。選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2區域基因序列，采用MEGA X軟件中的鄰接（neighbor-joining）法構建系統發育樹。

1.3.2 菌株YM7的釀造學特性分析

（1）生長曲線測定

將供試菌株YM7與釀酒酵母X16分別以終濃度為108CFU/mL的接種量接種至YPD液體培養基中，28 ℃、180 r/min恒溫培養，每隔4 h取樣一次，平行重復3次，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。共計取樣10次，取樣時間40 h。以各培養時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標繪制菌株的生長曲線。

（2）糖發酵試驗

將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量分別接種于含2%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖的0.6%的酵母浸粉溶液中，酵母浸粉溶液置于含杜氏小管的試管中，以菌株X16為對照組，28 ℃恒溫培養48 h，觀察杜氏小管頂部是否有氣泡。若有氣泡產生，記為“+”（陽性反應），反之，則記為“-”（陰性反應）。

（3）生理耐受性測定

葡萄糖耐受性：將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量接種于含葡萄糖質量濃度分別為100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L的YPD液體培養基中，平行重復實驗3次，以菌株X16為對照組，28 ℃、180 r/min培養34 h。培養結束后，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

酒精耐受性：將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量接種于含酒精體積分數分別為3%、6%、9%、12%、15%的YPD液體培養基中，平行重復實驗3次，以菌株X16為對照組，28 ℃、180 r/min培養34 h。培養結束后，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

SO2耐受性：將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量接種于含SO2質量濃度分別為50 mg/L、100 mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L的YPD液體培養基中，平行重復實驗3次，以菌株X16為對照組，28 ℃、180 r/min培養34 h。培養結束后，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

酸耐受性：將供試菌株YM7以終濃度為108CFU/mL的接種量分別接種于含不同檸檬酸質量濃度（15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L）的YPD液體培養基中，平行重復實驗3次，以菌株X16為對照組，28 ℃、180 r/min培養34 h。培養結束后，在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

（4）β-葡萄糖苷酶酶活測定

采用p-NPG法分析供試菌株YM7產β-葡萄糖苷酶的能力[16]。酶活力單位定義：在40 ℃、pH 5.0條件下，1 min水解p-NPG產生1 μmol p-NP所需酶量為一個酶活力單位，U/mL。

（5）硫化氫測定

取10 μL菌體濃度為108CFU/mL的供試菌株YM7的菌液滴加至亞硫酸鉍培養基表面的無菌濾紙片上，液體完全吸收后，28 ℃倒置培養5 d，觀察濾紙片變色情況。以菌株X16為對照組，菌株產硫化氫能力由高到低，顯色情況分別為顯棕黑色、棕色、墨綠色、淡墨綠色及不顯色[19]。

1.3.3 葡萄酒的制備[20]

取新鮮的北紅葡萄汁（帶皮壓榨），加入50 mg/L的SO2和600 mg/L的二甲基二碳酸鹽過夜滅菌處理，加入白砂糖調整糖度至24°Bx，并分成兩組，置于2 L無菌三角瓶中，每組平行重復3次。第一組（釀酒酵母組）：接種107CFU/mL的菌株X16；第二組（混合發酵組）：同時接種108CFU/mL的菌株YM7和107CFU/mL的菌株X16，26 ℃靜置發酵。

1.3.4 葡萄酒指標的測定

（1）理化指標的測定

參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定葡萄酒酒精度、總酸及揮發酸含量。采用優化的蒽酮法[21]測定葡萄酒總糖含量。

（2）香氣成分測定[22]

采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）結合GC-MS法測定葡萄酒中的香氣成分。美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）14.L標準譜庫檢索并匹配GC-MS采集得到的數據，進行定性分析。以環己酮（273.5 mg/L）為內標物，采用內標法進行香氣物質的定量分析。

1.3.5 數據分析

采用Excel 2007對數據進行整理和作圖，數據結果以“平均值±標準差”表示。Adobe Photoshop CS輔助作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株YM7的鑒定

2.1.1 形態觀察

菌株YM7的菌落及細胞形態見圖1。由圖1可知，菌株YM7在WL營養瓊脂培養基上的菌落呈黃白色，平鋪，邊緣不整齊，有褶皺，不透明；細胞近似橢圓狀、出芽生殖。根據菌落形態與細胞形態，初步鑒定菌株YM7為畢赤酵母屬[23]。

圖1 菌株YM7的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain YM7

2.1.2 分子生物學鑒定

基于26S rDNA基因序列構建菌株YM7的系統發育樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株YM7與畢赤酵母（Pichia kluyveri）菌株JE-22（JQ771710.1）聚于一支，親緣關系最近，結合形態觀察結果，鑒定菌株YM7為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）。

圖2 基于26S rDNA D1/D2區域序列菌株YM7的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain YM7 based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence

2.2 菌株YM7的釀造學特性

2.2.1 菌株YM7的生長曲線

菌株YM7的生長曲線見圖3。由圖3可知，菌株YM7的遲滯期為0～4 h，對數生長期為4～8 h，8 h后進入穩定期，遲滯期、對數生長期與菌株X16的基本一致。在穩定期的20 h以后，菌體濃度略低于菌株X16。因而，菌株YM7與商業化菌株S.cerevisiaeX16的生長性能較為相似。

圖3 菌株X16與菌株YM7的生長曲線Fig.3 Growth curves of strains X16 and YM7

2.2.2 菌株YM7的糖代謝能力

糖代謝實驗結果表明，菌株YM7可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖進行發酵。

2.2.3 菌株YM7的生理耐受性

菌株YM7的生理耐受性實驗結果見圖4。

圖4 菌株X16與YM7的生理耐受性實驗結果Fig.4 Results of physiological tolerances tests of strains X16 and YM7

由圖4可知，菌株YM7可耐受300 g/L的葡萄糖，但菌體OD600nm值隨著葡萄糖質量濃度的增加有降低的趨勢，且在各種葡萄糖質量濃度下，菌體OD600nm值均低于菌株X16；菌株YM7可耐受體積分數3%的乙醇，當乙醇體積分數為6%時，菌體OD600nm值迅速降低，當乙醇體積分數達到9%，菌體無法生長，在各種乙醇體積分數條件下菌體OD600nm值均低于菌株X16；菌株YM7二氧化硫耐受性與檸檬酸耐受性與X16較為相似，差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.4 菌株YM7產β-葡萄糖苷酶能力

采用p-NPG顯色法分析了菌株YM7的β-葡萄糖苷酶產生能力，結果見表1。由表1可知，菌株YM7的胞外酶活及胞內酶活均顯著低于菌株X16（P＜0.01），細胞壁酶活與菌株X16無顯著差異（P＞0.05）。

表1 菌株X16及YM7的β-葡萄糖苷酶產生能力測定結果Table 1 Determination results of β-glucosidase production ability of strains X16 and YM7

2.2.5 菌株YM7產硫化氫能力

菌株YM7的硫化氫產生能力見圖5。由圖5可知，菌株YM7的濾紙片呈棕黑色，且顏色比菌株X16深，因此，說明菌株YM7產硫化氫的能力高于菌株X16。硫化氫是一種具有臭雞蛋味的氣體，對酒體具有不良的影響[19]。菌株YM7產硫化氫量高于商業化S.cerevisiaeX16，因而后期可結合各種育種技術，對該菌株進行改造，使其控制在一定的范圍。

圖5 菌株X16及YM7硫化氫產生能力測定結果Fig.5 Determination results of hydrogen sulfide production ability of strains X16 and YM7

2.3 葡萄酒檢測分析結果

2.3.1 理化指標分析

兩組葡萄酒的基本理化指標見表2。由表2可知，兩組處理均完成了乙醇發酵，殘糖量均＜4g/L，酒精度為12.16%vol～12.45%vol。與釀酒酵母組酒樣相比，混合發酵組酒樣中總酸含量升高，揮發酸含量降低，分別為6.17 g/L、0.29 g/L，說明菌株YM7可調節葡萄酒中酸類物質含量，包括總酸和揮發酸。

表2 葡萄酒基本理化指標測定結果Table 2 Determination results of basic physical and chemical indicators of wine

2.3.2 香氣特性分析

由圖6可知，從兩組酒樣中檢測到酸類、醇類、酯類及其他類物質，兩組酒樣其他類物質含量無顯著性差異（P＞0.05）；混合發酵組酒樣揮發性醇類物質為127.35 mg/L、酸類物質含量為2.78 mg/L，均低于釀酒酵母組酒樣（137 mg/L、3.45 mg/L），揮發性酯類物質含量（75.87 mg/L）高于釀酒酵母組（64.35 mg/L）。

圖6 兩組葡萄糖酒樣中揮發性香氣物質含量測定結果Fig.6 Determination results of volatile aroma compounds contents in two groups of wine samples

非釀酒酵母是一大類除釀酒酵母之外的多種酵母類群總稱，由于其最初是從腐敗的葡萄中分離得到的，因而一直被認為污染菌，未受到重視[24]。隨著人們對非釀酒酵母菌認識的不斷加深，發現某些非釀酒酵母菌可產生較多的風味物質，有助于增加酒體風味物質的豐富性和復雜性，對葡萄酒的品質具有積極作用。越來越多的非釀酒酵母被用于多種酒類的生產，且某些菌株已商業化[25-27]。本研究發現來源于鮮食葡萄的一株克魯維畢赤酵母YM7，可調節葡萄酒酸類物質和揮發性香氣物質品質特性，因而在葡萄酒生產中具有一定的應用價值。

3 結論

本研究鑒定并深入分析了一株鮮食葡萄來源酵母菌株的釀造學特性，結果表明，菌株YM7為一株畢赤酵母（Pichia kluyveri），其生長特性、二氧化硫耐受性以及檸檬酸耐受性和商業化的S.cerevisiaeX16性能接近，葡萄糖耐受性低于菌株X16。該菌株對乙醇敏感，僅可耐受體積分數3%的乙醇，β-葡萄糖苷酶和硫化氫生產能力分別低于、高于菌株X16。此外，與S.cerevisiaeX16單獨發酵葡萄酒相比，葡萄酒揮發酸含量，香氣化合物中酸類、醇類物質含量均降低，酯類物質含量增加。綜上，Pichia kluyveriYM7具有良好生長特性、耐受性和發酵特性等釀造學特性，初步判斷為一株優良葡萄酒釀造菌株，具有一定的潛在應用價值。