黃色脆嫩金針菇菌株‘冀金12’的選育

李 慧，夏偉偉，高春燕，王朝江

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 遺傳生理研究所，石家莊 050051)

金針菇(Flammulinafiliformis)隸屬冬菇屬，又名構(gòu)菌、冬菇、毛柄金錢菌等，是我國最重要的栽培食用菌之一[1]，主要包括季節(jié)性農(nóng)藝設(shè)施栽培和周年工廠化栽培兩種模式.黃色金針菇因其外觀色澤豐富、氨基酸和多糖含量高、鮮味濃郁等優(yōu)點(diǎn)，市場(chǎng)接受度較高[2].黃色品種比白色品種溫度適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)，但頭茬產(chǎn)量不高，主要以農(nóng)藝設(shè)施栽培為主[3].農(nóng)藝設(shè)施栽培的黃色金針菇主要用于加工，鮮菇商品性較差，主要是因?yàn)楣襟w見光易褐變、菌柄粗壯韌性大(木質(zhì)素含量高)導(dǎo)致鮮菇適口性較差[4].另一方面由于菌種不斷擴(kuò)繁同時(shí)缺乏科學(xué)有效的菌種保藏技術(shù)，傳統(tǒng)品種已經(jīng)出現(xiàn)菌種老化和退化的現(xiàn)象，表現(xiàn)在產(chǎn)量降低、抗病性下降等[5].近幾年已有關(guān)于工廠化栽培黃色金針菇的研究[6-8]，但商業(yè)化生產(chǎn)還未見規(guī)模.張根偉等[6]認(rèn)為工廠化立瓶栽培的金針菇，在搔菌后出現(xiàn)“吐水”，容易使原基淹沒缺氧從而導(dǎo)致產(chǎn)量下降.沈穎越等[9]認(rèn)為黃色金針菇較白色品種首潮產(chǎn)量不高而處于劣勢(shì).因此，開展黃色金針菇優(yōu)良新種質(zhì)創(chuàng)制工作具有重要意義.

以一株栽培菌株為單核親本來源，通過原生質(zhì)體制備技術(shù)獲得單核親本，以一株野生菌株為雙核親本，進(jìn)行雙單雜交及出菇試驗(yàn)篩選，最終選育出了一株適宜農(nóng)藝設(shè)施栽培、商品性好且高產(chǎn)的新菌株，并進(jìn)一步采用分子標(biāo)記分析雜交子與親本核的遺傳關(guān)系用于證明雜交子的真實(shí)性.該研究為豐富黃色金針菇種質(zhì)資源、新品種選育提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐.

1 材料和方法

1.1 供試菌株

以河北省栽培用黃色金針菇菌株FH1和野生菌株FJH為供試材料，栽培菌株FH1的子實(shí)體特性表現(xiàn)為：菌蓋中等大小、鐘形，表面呈淺黃色；菌柄粗壯，但菌柄基部顏色較深，見光易發(fā)生褐變，呈深褐色影響外觀，菌柄基部絨毛多且黏連.野生菌株FJH的子實(shí)體特性表現(xiàn)為：菌蓋直徑較大、易開傘，表面呈金黃色；菌柄較為纖細(xì)，菌柄顏色較為均勻，呈黃白色，不易發(fā)生褐變，菌柄絨毛少且不黏連，但產(chǎn)量較栽培菌株低.供試菌株均來自河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所.

1.2 選育方法

1.2.1 技術(shù)路線 雜交新菌株選育的技術(shù)路線按照以下技術(shù)路線進(jìn)行：原生質(zhì)體單核親本的制備→雙單雜交子的構(gòu)建→雜交子的初篩→優(yōu)良雜交菌株的復(fù)篩→雜交子的真實(shí)性鑒定.

1.2.2 原生質(zhì)體單核親本的制備 根據(jù)供試菌株的子實(shí)體性狀及育種目標(biāo)，選取FH1的原生質(zhì)體單核菌株作為單核親本，原生質(zhì)體單核體的制備與再生方法參照陳鵬等[10]的方法進(jìn)行，原生質(zhì)體單核體交配型的測(cè)定參照王波等[11]的方法進(jìn)行.

1.2.3 雙單雜交子的構(gòu)建 選取30～50個(gè)FH1的原生質(zhì)體單核菌株(標(biāo)記為FH1Px)的菌絲塊接種在PDA培養(yǎng)基平板上的一側(cè)，25 ℃下培養(yǎng)4 d，菌落生長至直徑為2 cm左右時(shí)，在平板的另一側(cè)分別接種直徑約為0.5 cm大小的雙核菌株FJH的活化菌絲塊，接種位置距離單核菌絲邊緣為1 cm，兩種菌絲對(duì)峙培養(yǎng)直至兩種菌絲接觸.在單核菌株一側(cè)，遠(yuǎn)離雙核菌絲的位置用接種針取出直徑為0.3～0.5 cm的菌絲塊接種到一個(gè)新的PDA斜面培養(yǎng)基上，待菌絲直徑生長至1～2 cm，顯微鏡下觀察菌絲是否有鎖狀聯(lián)合.將有鎖狀聯(lián)合的菌絲與親本FJH進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，凡是與兩親本菌株之間出現(xiàn)溝狀、或隆起、或隔離現(xiàn)象的初步確定為雜交子，標(biāo)記為FHJ-x(x編號(hào)與單核親本FH1Px的編號(hào)一致).

1.2.4 雜交子的初篩 將雜交子進(jìn)行菌絲培養(yǎng)，選擇菌絲濃密、生長速度快的雜交子進(jìn)行出菇試驗(yàn)初篩，出菇方法參照王朝江等[3]的方法進(jìn)行.當(dāng)子實(shí)體高度生長至20～25 cm、菌蓋直徑為0.3～0.5 cm時(shí)采收，篩選菌蓋不易開傘，菌柄色淺不易發(fā)生褐變、纖細(xì)、基部絨毛少不黏連，產(chǎn)量高于親本的菌株進(jìn)入復(fù)篩.

1.2.5 優(yōu)良雜交菌株的復(fù)篩 金針菇子實(shí)體脆嫩程度是衡量金針菇品質(zhì)的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)[4]，金針菇菌柄木質(zhì)化會(huì)使菌柄質(zhì)地變硬而粗糙從而影響食用品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12]，因此本研究采用菌柄木質(zhì)素含量來評(píng)價(jià)菌柄的脆嫩程度并作為優(yōu)良雜交子復(fù)篩的標(biāo)準(zhǔn).木質(zhì)素含量測(cè)定參考方東路等[12]的方法稍做修改：挑選菇體完整、無病蟲害、無機(jī)械損傷、子實(shí)體七成熟的新鮮金針菇子實(shí)體，取菌柄由上往下2/3處菌肉組織，鮮重1 g，加5 mL 95%乙醇后，研磨，離心7 min，棄上清液，取沉淀物，用95%乙醇沖洗3次，再用體積比為1∶2的乙醇、正己烷的混合溶劑沖洗3次，收集沉淀物，充分干燥后，將干燥物溶于25%溴乙酰冰醋酸溶液中，在70 ℃恒溫水浴中保溫30 min，然后加入0.9 mL 2 mol/L NaOH終止反應(yīng)，加入5 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L的羥胺鹽酸，并以冰醋酸定容至10 mL，離心7 min，取上清液，在280 nm處測(cè)定吸收值，以每克鮮重在280 nm處的吸收值表示木質(zhì)素含量，重復(fù)3次，取平均值作為菌柄的木質(zhì)素含量.

1.2.6 雜交子真實(shí)性鑒定 雙單雜交子是親本單核體與親本雙核體中一個(gè)細(xì)胞核構(gòu)成的新雙核體，不親和因子基因型分析證明，雙單雜交子的單核原生質(zhì)體基因型一個(gè)與受體核(來自單核親本)相同，另一個(gè)與供體核(來自雙核親本)的基因型相同[13]，因此可以通過比較雜交子與受體核和供體核的親緣關(guān)系來證明雜交子的真實(shí)性.根據(jù)交配型檢測(cè)結(jié)果確定親本的受體核和供體核，選取雜交子、單核親本、單核親本的出發(fā)菌株、雙核親本及其供體核菌株為樣本，采用ISSR(inter-simple sequence repeats)分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳關(guān)系分析來鑒定雜交子的真實(shí)性.選擇16對(duì)ISSR引物(如表1所示)對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增.20 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系：1 μL模板，2 μL引物，10 μL 2×Taq MasterMix，7 μL ddH2O.擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃充分預(yù)變性4 min，然后94 ℃變性30 s，50～55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min并終止反應(yīng).擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).分析統(tǒng)計(jì)供試菌株ISSR擴(kuò)增圖譜的多態(tài)性條帶，將結(jié)果中穩(wěn)定出現(xiàn)的多態(tài)性條帶記為1，無該條帶的記為0，生成“0/1”矩陣表，用NTSYSpc 2.1專業(yè)版軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，對(duì)5個(gè)菌株進(jìn)行UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic)聚類分析，得出聚類圖譜.

表1 ISSR引物信息Tab.1 ISSR primers used in this study

注：同列數(shù)值后不同大寫英文字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 雙單雜交子的獲得

金針菇菌株FH1共獲得了37株原生質(zhì)體單核菌株，其中交配型為A1B1的有24株，交配型為A2B2的有13株.將這37株單核菌株作為單核親本分別與FJH進(jìn)行雙單雜交，最終成功獲得了13個(gè)雙核菌株.交配型測(cè)定結(jié)果如表2所示，野生菌株FJH的交配型為A1B2×A3B3，因此，F(xiàn)H1Px和FJH實(shí)際上發(fā)生了單因子相同的不完全親和雙單雜交，進(jìn)一步推斷雜交子的交配型應(yīng)該為A2B2×A3B3.拮抗試驗(yàn)結(jié)果顯示，這13個(gè)雙核菌株與單核親本均產(chǎn)生了拮抗反應(yīng)，但與雙核親本拮抗不明顯，初步確定這13個(gè)雙核菌株為雜交形成的新菌株.

表2 金針菇菌株交配型測(cè)定Tab.2 The result of mating type of Flammulina filiformis strains

2.2 雜交子的初篩結(jié)果

將13個(gè)初步確定為雜交子的菌株進(jìn)行兩兩拮抗試驗(yàn)顯示，菌株間無拮抗反應(yīng)，比較菌絲生長速率結(jié)果顯示菌株間也無顯著差異，且雜交子的生長速率均大于單核親本和雙核親本.從出菇產(chǎn)量上來看(如表3所示)，13個(gè)雜交子的單潮單袋平均出菇產(chǎn)量均高于野生雙核親本，其中有2個(gè)菌株FHJ-12和FHJ-28的產(chǎn)量顯著高于栽培菌株FH1，但兩者之間無顯著差異，經(jīng)菇潮間期補(bǔ)水出菇技術(shù)，可以出三潮菇，平均總生物學(xué)效率在120%～140%之間，顯著高于已報(bào)道栽培品種的105%～128%[3].在子實(shí)體形態(tài)特征上差異不明顯，均表現(xiàn)為：菇體呈金黃色、菌蓋大小介于FH1和FJH之間、不易開傘，菌柄纖細(xì)不黏連、菌柄基部黃白色不易褐變.根據(jù)以上結(jié)果，選取雜交子FHJ-12和FHJ-28兩菌株進(jìn)入復(fù)篩.

表3 雜交子與親本菌株的產(chǎn)量Tab.3 The yield of hybrid strains and their parent strains

2.3 優(yōu)良雜交子的復(fù)篩結(jié)果

分別測(cè)定兩個(gè)雜交子與親本菌株的采收期子實(shí)體菌柄的木質(zhì)素含量，結(jié)果顯示雜交子FHJ-12和FHJ-28子實(shí)體菌柄的平均木質(zhì)素含量不高于2.50×103(A280 nm)/kg，顯著低于栽培菌株FH1的3.05×103(A280 nm)/kg，雜交子的菌柄直徑平均為0.25 cm左右也顯著小于栽培的0.45 cm.兩個(gè)雜交子FHJ-12和FHJ-28子實(shí)體性狀無明顯差異，表現(xiàn)為菌蓋呈金黃色、顏色亮麗，菌柄纖細(xì)不黏連，菌柄顏色為黃白色且不易褐變，最終選取產(chǎn)量略高的雜交子FHJ-12為優(yōu)良雜交菌株，命名為‘冀金12’，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.19644.雜交新菌株冀金12和栽培菌株FH1的子實(shí)體形態(tài)如圖1所示.

圖1 栽培菌株FH1(A)與雜交菌株FHJ-12(B)的子實(shí)體形態(tài)Fig.1 Basidiomata of cultivar FH1 (A) and breeder FHJ-12 (B)

泳道M、1-5分別代表DNA Maker,FHJ-12,FH1P12,FJH,FH1,FJHP16圖2 引物P1的ISSR-PCR擴(kuò)增圖譜Fig.2 The ISSR-PCR amplification map of primer P1

2.4 雜交子真實(shí)性鑒定

交配型測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果證明單核親本FH1P12(A2B2)與雙核親本FJH(A1B2×A3B3)發(fā)生不完全親和雙單雜交得到雜交子FHJ-12(A2B2×A3B3).通過原生質(zhì)體制備和再生技術(shù)得到雙核親本FJH的兩種交配型的原生質(zhì)體單核菌株FJHP16和FJHP18，分別與單核親本FH1P12進(jìn)行配對(duì)試驗(yàn)，結(jié)果為FJHP16與FH1P12親和，F(xiàn)JHP18與FH1P12不親和，因此證明FJHP16為供體核，其交配型為A3B3.以雜交子FHJ-12、單核親本FH1P12、雙核親本FJH、單核親本的出發(fā)菌株FH1和雙核親本供體核菌株FJHP16的DNA為模板，采用16對(duì)ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選到8對(duì)能擴(kuò)增出條帶清晰且具多態(tài)性的引物(部分引物的擴(kuò)增圖譜如圖2所示)，共獲得52條清晰易辨的多態(tài)性條帶.將供試菌株的ISSR擴(kuò)增圖譜轉(zhuǎn)化為“0/1”數(shù)據(jù)矩陣，采用NTSYSpc 2.1專業(yè)版軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，結(jié)果顯示基于ISSR數(shù)據(jù)的遺傳相似性系數(shù)變異范圍為0.37～0.81，從遺傳相似性系數(shù)來看，野生菌株FJH較栽培菌株間的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，其包含的遺傳多樣性也更為豐富.UPGMA聚類圖(如圖3所示)結(jié)果顯示雜交子FHJ-12與其雙核親本FJH間親緣關(guān)系最近，其次是雙核親本供體核菌株FJHP16，與其單核親本FH1P12及單核親本的出發(fā)菌株FH1間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳關(guān)系分析結(jié)果證明菌株FHJ-12為FHIP12和FJH雙單雜交獲得的雜交子.

圖3 菌株FHJ-12的ISSR聚類圖Fig.3 ISSR dendrogram of FHJ-12

3 討論

雙單雜交技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于金針菇新品種的選育，育種者已經(jīng)獲得了川金5號(hào)、川金33、農(nóng)金7號(hào)[14-16]等一系列優(yōu)良品種.金針菇雙單雜交種的鑒定通常采用“顯微鏡檢初步確認(rèn)+拮抗再鑒定”的方法，具體為顯微鏡觀察將有鎖狀聯(lián)合的菌種初步確定為雜交種，再與親本菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，凡是與兩親本菌株之間出現(xiàn)溝狀、或隆起、或隔離現(xiàn)象的確定為雜交種.但在具體操作中，菌絲培養(yǎng)耗時(shí)且顯微鏡檢容易發(fā)生人為因素誤檢[17]，而且有些金針菇雙核菌株間拮抗特征不明顯，尤其是親緣關(guān)系較近的雜交子與雙核親本的菌落形態(tài)十分相似，很難正確判斷.本研究根據(jù)雙單雜交形成原理，分別找到受體核和供體核，進(jìn)一步采用分子標(biāo)記的方法分析兩個(gè)親本核與雜交子核基因的遺傳關(guān)系，不僅準(zhǔn)確可靠的鑒定了雜交子的真實(shí)性，而且還有利于菌株親本的追溯.

本研究中雙單雜交的單核親本是通過原生質(zhì)體單核化獲得，沒有經(jīng)過有性階段，理論上更好地保持了親本菌株的遺傳性狀[18]，與同樣具有優(yōu)良性狀的雙核菌株雜交也就更容易達(dá)到定向選育優(yōu)良菌株的目的.雜交后代作為同質(zhì)異核體，細(xì)胞質(zhì)環(huán)境由單核受體提供，雜交后代遺傳性狀和表型更接近受體[19]，王波等[13]通過金針菇雙單雜交ISSR聚類分析顯示，雙單雜交子與其單核親本間親緣關(guān)系較近.本研究同樣采用ISSR分子標(biāo)記分析了雜交子與親本之間的親緣關(guān)系，通過UPGMA聚類分析顯示，雜交子FHJ-12與供體核的出發(fā)菌株即雙核親本FJH親緣關(guān)系最近，與單核親本間關(guān)系較遠(yuǎn)，并且雜交子的子實(shí)體顏色、菌柄粗細(xì)、菌柄基部黏連程度等性狀也更接近于野生菌株FJH.由此可見，雙單雜交子的遺傳性狀和表型并不一定更接近單核親本.在雙單雜交發(fā)生的過程中，雙核親本的供體核基因?qū)κ荏w核基因的顯隱性控制以及兩個(gè)核基因的基因重組可能最終決定了雜交子的表型，這需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證.