青藏高原狹果茶藨子對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性及作用機理

劉耀耀，劉哲，李珊，王金美，葉英,2*，曹效海*

1(青海大學 農牧學院，青海 西寧,810016)2(青海省青藏高原農產品加工重點實驗室，青海 西寧,810016)

隨著食品科學領域的發展，食品安全逐漸成為食品工業中不可忽視的全球性問題，由微生物引起的食品腐敗與疾病給世界各國造成了損失，目前廣泛應用的化學防腐劑價格低廉，雖然可以抑制細菌生長，但對人體有一定的致畸、致癌和致突變作用。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種內生芽孢的革蘭氏陽性桿狀菌，寄生于土壤中，污染多種食品，如大米、蔬菜、雞蛋、肉制品、乳制品等[1]，蠟樣芽孢桿菌是與食物中毒相關的食源性致病菌之一，能產生多種毒素[2]導致腹瀉和嘔吐等癥狀，因此尋找高效安全的天然保鮮劑來應對食品腐敗菌具有重大意義。

狹果茶藨子(RibesstenocarpumMaxim)屬虎耳草科植物，全世界約有160種，青海省有11種，1個變種[3]。茶藨子為落葉灌木，生于山坡灌叢、云杉林和雜木林下或山溝中[4]。研究發現，茶藨子的化學成分主要為不飽和脂肪酸、有機酸、多糖、黃酮類化合物等[5]。前期研究發現，青藏高原狹果茶藨子提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等具有一定的抑制作用[6]，具有成為新型多功能食品添加劑的潛力，為了拓寬狹果茶藨子在食品防腐保鮮中的應用，本研究以蠟樣芽孢桿菌為試驗菌，探究青藏高原狹果茶藨子提取物對其抑菌作用及作用機理，以期為狹果茶藨子天然食品保鮮劑的研發提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

狹果茶藨子產自青海大通東峽鄉；蠟樣芽孢桿菌(CMCC(B) 63303)，上海魯微科技有限公司；超微量ATP酶、蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、堿性磷酸酶試劑盒，南京建成生物科技有限公司；碘硝基氯化四氮唑藍(iodonitrotetrazolium chloride，INT)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RF-6000熒光分光光度計，日本島津公司；Micro-GCM微生物生長曲線儀，德國BMG公司；JSM-6610LV掃描電鏡，日本電子公司；MF1顯微細胞分析/菌落計數/抑菌圈測量聯用儀，杭州迅數科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 狹果茶藨子粗提物的制備

狹果茶藨子低溫烘干，粉碎，過60目篩，取1 000 g樣品加入95%乙醇回流提取2 h，提取2次，過濾后合并濾液并濃縮，得到總粗提物80 g，分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取，制備乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物。

采用AB-8大孔樹脂進一步分離純化乙酸乙酯提取物(40 g)，分別用蒸餾水、20%、40%、60%、80%、100%(體積分數)乙醇梯度洗脫，收集不同極性洗脫液，濃縮，低溫冷凍干燥，得組分DW1、DW2、DW3、DW4、DW5、DW6，其中DW1為19 g，4 ℃密封儲存備用。

1.3.2 抑菌活性測定

將蠟樣芽孢桿菌活化后，用無菌生理鹽水稀釋，比濁至0.5麥氏單位，配制不同濃度狹果茶藨子提取物，并放入藥敏紙片浸泡12 h，采用紙片擴散法進行抑菌實驗，菌落計數器測量抑菌圈直徑[7]。

1.3.3 最低抑菌濃度和最低殺死濃度測定

參照KANG等[8]的方法測定最低抑菌濃度和最低殺死濃度。

1.3.4 生長曲線測定

將細菌接至含有提取物的96孔板，使終濃度分別為1/16最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)，置于微生物生長曲線檢測系統中培養35 h(37 ℃ 200 r/min)，每30 min測定1次，繪制生長曲線[9]。

1.3.5 細胞膜膜蛋白測定

參照WANG等[10]的方法測定蠟樣芽孢桿菌細胞膜膜蛋白的熒光光譜。

1.3.6 堿性磷酸酶測定

參照SONG等[11]的方法測定堿性磷酸酶活性。

1.3.7 核酸及蛋白質泄漏試驗

參照LIU等[12]的方法測定核酸蛋白質泄露。

1.3.8 ATP酶測定

參照WANG等[13]的方法測定蠟樣芽孢桿菌中Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶、T-ATP酶的活性。

1.3.9 呼吸鏈脫氫酶測定

取培養4 h的蠟樣芽孢桿菌與1 mL提取物混合，37 ℃ 120 r/min條件下振蕩培養1 h，菌懸液離心并用生理鹽水清洗，加入2.7 mL PBS 和0.3 mL INT混合后于室溫下避光暗處理1 h，490 nm[14]下測定吸光度值。

1.3.10 掃描電鏡觀察

參照LI等[15]的方法觀察細胞微觀變化。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 抑菌活性篩選

狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌抑菌效果如表1所示，抑菌圈直徑大小關系為乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提取物，抑菌活性與提取物濃度成正比，當乙酸乙酯提取物質量濃度為400 mg/mL時，抑菌圈直徑(19.21±0.11) mm，表現為高敏，效果明顯優于正丁醇提取物和水提取物，說明乙酸乙酯提取物為抑制蠟樣芽孢桿菌的有效活性部位。

表1 不同提取物濃度對蠟樣芽孢桿菌抑菌圈直徑的影響 單位：mm

乙酸乙酯提取物經AB-8大孔吸附樹脂分離純化后，得到6個組分，其抑菌效果如表2所示，其中DW1組分抑菌活性最強，其次為DW2組分，其他組分則無抑菌作用；當DW1質量濃度為300 mg/mL時，抑菌圈直徑(18.54±0.52) mm，表現為高敏，與食品中常用的防腐保鮮劑丙酸鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉和脫氫乙酸鈉比較，丙酸鈉與山梨酸鉀對蠟樣芽孢桿菌無抑制作用，苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、青霉素和氨芐西林抑菌圈直徑均小于DW1，因此后期抑菌機制試驗選用DW1組分進行，抑菌效果DW1>脫氫乙酸鈉>苯甲酸鈉>山梨酸鉀=丙酸鈉，DW1抑菌效果優于陽性對照藥氨芐西林(10/10 μg)和青霉素(10 U)。

表2 不同組分對蠟樣芽孢桿菌抑菌圈直徑的影響 單位：mm

2.2 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌具有較強抑制作用，實驗結果表明，MIC為3.13 mg/mL，MBC為6.25 mg/mL，為MIC的2倍，空白對照無抑菌作用。

2.3 蠟樣芽孢桿菌生長曲線測定結果

狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌生長影響如圖1所示，對照組遲緩期為1 h，隨后進入對數期，5 h后進入穩定期，35 h內未進入衰亡期，MBC和MIC組吸光值變化較小，即細菌生長較少，1/2 MIC組第16 h進入生長期，持續至26 h，1/4 MIC組2 h時進入生長期，12 h進入穩定期，1/8 MIC組與1/16 MIC與對照相差較小，抑制作用不明顯，結果表明，當濃度為MIC和MBC時，提取物抑制蠟樣芽孢桿菌生長繁殖，當濃度為1/2 MIC和1/4 MIC時，表現為遲緩期和對數生長期延長。

圖1 不同濃度狹果茶藨子提取物下蠟樣芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Growth curves of B.cereus under different concentrations of R.stenocarpum extract

2.4 提取物濃度對蠟樣芽孢桿菌膜蛋白的影響

膜蛋白是細胞的重要組成部分，在物質運輸、細胞識別、信號傳導等方面具有重要功能。膜蛋白中含有苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)和色氨酸(tryptophan， Trp)等氨基酸，可以在膜蛋白中發出熒光。KI是一種熒光淬滅劑，可以定性確定Phe、Trp、Tyr殘基在蛋白質中的位置。圖2顯示了不同濃度KI處理蠟樣芽孢桿菌膜蛋白氨基酸殘基的熒光光譜，KI濃度從上到下依次為0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mol/L。結果表明，隨著KI濃度增加苯丙氨酸熒光淬滅效果明顯，色氨酸和酪氨酸熒光淬滅效果不明顯，表明色氨酸和酪氨酸殘基主要位于細胞膜內部。圖3顯示了不同濃度狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌膜蛋白熒光光譜的影響，提取物濃度從上到下依次為1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、MBC，結果表明，隨著提取物濃度增加，各氨基酸熒光強度均逐漸下降、當濃度為MIC和MBC時，伴隨明顯紅移，這表明狹果茶藨子提取物可能與膜蛋白結合，改變了蠟樣芽孢桿菌細胞膜膜蛋白的結構和構象，使Phe、Trp 和Tyr 殘基變得更加親水[16]，導致細胞膜功能障礙和細胞損傷。

a-苯丙氨酸;b-色氨酸;c-酪氨酸圖2 不同濃度KI 下蠟樣芽孢桿菌膜蛋白氨基酸殘基熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of amino acid residues of B.cereus membrane proteins under different concentrations of KI

a-苯丙氨酸;b-色氨酸;c-酪氨酸圖3 不同濃度狹果茶藨子提取物下蠟樣芽孢桿菌膜蛋白氨基酸殘基熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of amino acid residues of B.cereus membrane proteins under different concentrations of R.stenocarpum extract

2.5 堿性磷酸酶活力測定結果

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)存在于細胞壁和細胞膜之間，當細胞壁被破壞，堿性磷酸酶會流出[17]。不同濃度狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌堿性磷酸酶活性影響如圖4所示，對照組AKP活性為1.11金氏單位/mg prot，MBC組AKP活性為3.60金氏單位/mg prot，是對照組的3.24倍，隨著提取物濃度的增大，AKP活性增加，說明蠟樣芽孢桿菌細胞壁受損越嚴重，堿性磷酸酶流出越多。

圖4 不同濃度狹果茶藨子提取物下蠟樣芽孢桿菌AKP活力影響Fig.4 AKP activity of B.cereus at the different concentrations of R.stenocarpum extract

2.6 核酸及蛋白質泄露結果

核酸和蛋白質對于細胞生長、新陳代謝、維持細胞功能有重要作用，細胞膜損傷，胞內物質就會泄露，細胞膜的完整性對細菌發育至關重要[18]。狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌核酸及蛋白質泄露影響結果如圖5所示，對照組核酸及蛋白質幾乎不發生泄露，12 h內OD280值、OD260值變化不大，經狹果茶藨子提取物處理后，蠟樣芽孢桿菌核酸蛋白質泄露與樣品濃度呈正相關，其中MBC組OD280值從0.01增加至0.16，OD260值從0.01增加至0.15，說明隨著時間和濃度增加，蠟樣芽孢桿菌核酸及蛋白質泄露程度加劇，即細胞膜破損越嚴重，進而影響細胞生長和新陳代謝，最終導致蠟樣芽孢桿菌死亡。

a-蛋白質泄露;b-核酸泄露圖5 不同濃度狹果茶藨子提取物下蠟樣芽孢桿菌核酸及蛋白質泄露Fig.5 Nucleic acid and protein leakage of B.cereus at different concentrations of R.stenocarpum extract

2.7 ATP酶活性測定結果

Na+K+-ATP酶即鈉鉀泵，能促進ATP的水解，能夠調節細胞內鈉/鉀離子濃度，為Na+、K+的跨膜運輸提供能量，從而保持細胞的靜息電位；Ca2+Mg2+-ATP酶主要功能是建立跨膜的離子梯度、維持細胞內外離子平衡及滲透壓平衡[19]。狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌ATP酶的影響結果如圖6所示，隨著提取物濃度升高，3種酶活性均升高，對照組Na+K+-ATP酶活性為11.99 U/mg prot，Ca2+Mg2+-ATP酶活性為3.79 U/mg prot，T-ATP酶活性為15.65 U/mg prot，MBC組Na+K+-ATP酶活性27.69 U/mg prot，為對照組的2.3倍，Ca2+Mg2+-ATP酶活性 8.34 U/mg prot，為對照組的2.2倍，T-ATP酶活性 59.47 U/mg prot，為對照組的3.8倍，以上數據表明，狹果茶藨子提取物能有效提高Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶及T-ATP酶的活性，激活蠟樣芽孢桿菌膜結合離子通道，顯著破壞細胞膜，增加細胞膜的通透性；細菌通過改變細胞膜內外離子濃度以抵抗不利環境的影響，保持細胞內外電化學梯度的平衡[20]，這與LI等[21]的研究一致。

圖6 不同濃度狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌ATP活性的影響Fig.6 Effects of ATPase activity of B.cereus at different concentrations of R.stenocarpum extract

2.8 呼吸鏈脫氫酶活力測定結果

呼吸鏈脫氫酶是TCA循環中的關鍵酶，反映了細胞呼吸作用的強度和生成ATP的能力[22]。狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌呼吸鏈脫氫酶活性影響如圖7所示，圖中對照組OD值為3.12，MBC組OD值為1.08(僅為對照組的1/3)，呼吸鏈脫氫酶酶活性隨提取物濃度的升高而降低，說明經狹果茶藨子提取物處理后蠟樣芽孢桿菌中呼吸鏈脫氫酶活性顯著下降，提取物可能通過抑制蠟樣芽孢桿菌呼吸鏈脫氫酶活性，進而抑制呼吸作用和能量供應，最終導致菌體細胞死亡。

圖7 不同濃度狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌呼吸鏈脫氫酶活力影響Fig.7 Effects of respiratory chain dehydrogenase activity of B.cereus at different concentrations of R.stenocarpum extract

2.9 掃描電鏡觀察結果

不同濃度提取物對蠟樣芽孢桿菌微觀形態影響如圖8所示，對照組蠟樣芽孢桿菌呈桿狀，無異常凸起或凹陷，細胞形態完整，表面光滑，MBC組細胞褶皺，表面有嚴重凸起和凹陷，細胞嚴重變形，MIC組細胞呈桿狀，表面有褶皺，表面不光滑，1/2MIC組部分細胞有褶皺、但形態完整，變形程度MBC組>MIC組>1/2MIC組>對照組，即變形程度與提取物濃度呈正相關，提取物濃度越高，細胞變形越明顯。

a-MBC;b-MIC;c-1/2 MIC;d-對照圖8 不同濃度狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌微觀形態影響Fig.8 SEM photomicrographs of B.cereus treated with different concentrations of R.stenocarpum extract

3 結論

本研究以青藏高原狹果茶藨子為原料，探討其對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性及作用機制，研究表明，狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌有明顯抑制作用，乙酸乙酯萃取物為抑制蠟樣芽孢桿菌的有效極性部位，且有效活性物質主要存在于DW1組分中，當其質量濃度為300 mg/mL時，抑菌圈直徑達(18.54±0.52) mm，表現為極敏；狹果茶藨子提取物對蠟樣芽孢桿菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度分別為3.13和6.25 mg/mL。初步抑菌機制試驗表明，狹果茶藨子提取物可以改變蠟樣芽孢桿菌細胞膜膜蛋白的構象，造成核酸和蛋白質泄露，破壞細胞壁，導致堿性磷酸酶流出，通過抑制琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、呼吸鏈脫氫酶的活力抑制呼吸作用和能量代謝，同時提高Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活力，激活膜結合離子通道，細胞膜內外離子濃度被改變以抵抗不利環境的影響；掃描電鏡結果表明狹果茶藨子提取物可導致蠟樣芽孢桿菌細胞嚴重變形，表面有異常凸起和凹陷，最終導致菌體細胞死亡。