生物加工技術對水產品主要過敏原的致敏性消減作用研究進展

肖葉，葉精勤，閻俊，施文正，盧瑛*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海，201306)

由水產食物引發的過敏性疾病作為重要的食品安全問題受到越來越多的關注，水產品的過敏反應由水產品本身或水產品接觸的各種非水產成分(包括各種污染物，如寄生蟲、細菌、化學添加劑等)引起[1]。近些年來，水產品生產量和貿易出口量不斷增加，由其引發的過敏性疾病發病率持續上升，給食物過敏患者的身體健康造成了威脅[2]。據統計，亞洲兒童食物過敏人群中，甲殼類水產品引發的過敏反應占39%，魚類占13.2%；而在成人中，甲殼類、軟體類水產品的過敏反應引發率分別為33.8%、18.9%[3-4]。由此可見，水產品引發食物過敏是我們必須重視的食品安全問題。

食物過敏在醫學領域被習慣性稱作變態反應，指外來抗原首次接觸機體，機體免疫細胞分泌相應的抗體來抵抗抗原的刺激，當同一種抗原再次刺激機體，細胞產生免疫反應，組織發生損傷或生理機能出現障礙[5]。目前還沒有有效的措施來治療食物過敏，只能通過人為避免接觸過敏原或在食品生產過程中，選用合適的加工技術消減致敏蛋白的致敏性。常見的食品加工技術按其作用原理可分為物理加工法、化學修飾法和生物處理法三大類，但熱處理[6]、輻照技術[7]、超聲波[8]等物理方法需特定的設備且消減效果一般，還會對食品品質造成影響；糖基化修飾[9]、強酸[10]、強堿水解[11]等化學方法處理過程較復雜，條件較難掌控，需要一定成本，且會降解其他蛋白質并影響食物口感；而酶改性[12]、發酵[13]、基因改良[14]等生物加工技術成本低，操作簡便，在不破壞營養品質的基礎上可改善食品特性，因此被廣泛應用于食品加工行業，成為過敏原消減領域新的研究熱點。本文綜述了酶改性、發酵、基因改良等生物加工技術及其優缺點，概括了利用生物加工技術消減水產品過敏蛋白致敏性的研究現狀以及消減機制，以期為今后利用生物加工技術開發低致敏性水產加工食品提供理論指導。

1 水產品的主要過敏原

近年來，國內外學者對食用水產品引起的過敏反應的研究不斷深入，常見的含有致敏蛋白的水產食物有硬骨魚類、甲殼類、貝類及一些軟體動物[15]。硬骨魚類的主要致敏蛋白為小清蛋白(parvalbumin, PV)，它富含于魚類的肌肉組織中，在水中溶解度極高，在高溫與酶的作用下不易被破壞，包括α和β兩種類型，分子質量約12 kDa，且不同種類魚肉中的PV同源性較高[16-17]。農小獻等[18]通過 X-射線衍射譜技術發現鯉魚PV的三級結構中有 6 個 α 螺旋,且它們兩兩結合成相同的蛋白體。甲殼類、貝類及軟體動物的主要致敏蛋白為原肌球蛋白(tropomyosin, TM))、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)和肌鈣結合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP)[19-20]。TM廣泛存在于甲殼類水產品和蛤蜊、貽貝等軟體動物的肌肉或非肌肉組織中，它的超螺旋結構中含有7個交互的肌動蛋白結合位點，相對分子質量在32～40 kDa，結構穩定且耐高溫[21]。AK最早發現于貝類水產品中，主要以單體形式存在，極少情況以二聚體形式被發現。AK結構復雜，有研究表明，斑節對蝦AK的N端結構域包含α-螺旋，而C端結構域由α-螺旋和β-折疊混合組成[22]。它的分子質量為40 kDa左右，與原肌球蛋白的不同之處在于，AK不耐熱，在熱的作用下，AK會形成多聚體[23]。SCP最早在斑節對蝦和太平洋白蝦中被發現，分子質量大約在20 kDa，它的結構和功能與脊椎動物體內PV的結構和功能相似性極高。有報道稱，SCP 具有多態性(SCP-I, SCP-II和SCP-III)，其中SCP-I和SCP-III與IgE的結合能力比SCP-II大[24]。

此外，肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)[25]、肌鈣蛋白(troponin C，TnC)[26]、血藍蛋白(hemocyanin，HMC)[27]、磷酸丙糖異構酶(triosephosphate isomerase，TPI)[28]、魚類膠原蛋白[29]、烯醇酶和肌酸激酶[30]等也相繼被國內外研究人員確認為水產品的新型過敏原。表1列舉了常見水產品的主要過敏蛋白及來源品種，具體如下：

表1 常見的水產品過敏蛋白Table 1 Common allergic proteins in aquatic products

2 生物加工技術對水產品過敏原致敏性的消減研究

以“enzyme，aquatic products, allergy”、“fermentation，aquatic products, allergy”、“genetic modification，aquatic products, allergy”分別為關鍵詞，在web of science中共檢索到2 995篇文獻，其中利用生物加工技術消減硬骨魚類過敏原致敏性的發表文章數為1 980篇，甲殼類和貝類為728篇，而利用生物加工技術消減軟體動物類過敏原致敏性的發表文章數較少，僅287篇。近五年發表文章數占全部檢索文獻的25%，其中硬骨魚類占15.1%，甲殼類和貝類占8.2%，軟體動物類占1.7%，且總體來說，利用生物加工技術消減水產品過敏原致敏性的文章發表數呈現逐年遞增趨勢(圖1)。這些數據表明，近些年來，生物加工技術對水產品過敏原致敏性的消減研究已經引發了科研人員極大的興趣，成為了當前的一個研究熱點。

圖1 年份-文章發表數Fig.1 Year-article publications

2.1 酶改性技術

酶改性技術的原理是致敏蛋白被蛋白酶水解成多肽或氨基酸等小分子物質，或蛋白質在酶的作用下發生分子內或分子間的交聯反應從而促使蛋白的交聯聚合，致敏蛋白的空間結構遭到破壞，致敏性會隨之發生改變[31]。MEJRHIT等[32]研究在消化液中蝦原肌球蛋白的致敏性是否穩定存在，間接ELISA和斑點免疫印跡結果表明，原肌球蛋白在人工胃液中極其不穩定，在胃蛋白酶水解作用下顯示出IgE結合能力的下降，這可能是因為原肌球蛋白的空間結構在蛋白酶的作用下發生了變化，造成其致敏性的改變。TIAN等[33]評價在不存在和存在咖啡酸的情況下，與酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)交聯后，大菱鲆的PV與IgG結合能力的變化，SDS-PAGE結果顯示，在交聯的PV中出現了更高的分子質量譜帶(24，36 kDa)且交聯PV的二級結構變得松散無序。蛋白免疫印跡和間接ELISA觀察到在Tyr處理后PV帶的強度降低，交聯PV的IgG結合能力降低了34.94%，熒光和紫外線吸收光譜分析也顯示酶法交聯后PV結構發生較大變化，結構的改變影響了PV的免疫活性。王學麗等[34]模擬TM的胃腸消化，采用質譜技術分析消化產物中氨基酸組成和序列是否發生變化，發現胃腸消化2 h 后，雖仍存在 3 個不被破壞的抗原表位(肽段 111～125、137～141、153～161)和 4 個抗消化能力很強的抗原表位(肽段 50～66、144～151、145～164、150～163)，但胃蛋白酶會破壞TM 的大部分抗原表位，對其致敏性產生一定影響。由此可見，酶改性技術利用蛋白酶的水解作用或酶促交聯反應，使得致敏蛋白的空間結構遭到破壞，氨基酸組成與序列發生改變，致敏表位遭到破壞，其致敏性由此發生變化。

2.2 發酵技術

利用乳酸菌發酵是當前應用較多的一種食品加工工藝，難溶解的大分子物質在乳酸菌分泌物的作用下分解為易溶的小分子物質[35]，通過改變食品中各組分的占比，使致敏蛋白的結構和性質發生變化，致敏性隨之改變。乳酸菌還可以調節相關炎癥因子的釋放，提升血清中IgA、IgM的水平[36]，調節CD3+、CD4+和CD8+T細胞的占比分配，改善腸道菌群的失衡狀態進而提高機體免疫能力，緩解食物過敏引起的不良反應[37]。高卿等[38]利用木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus，Sx)發酵海鱸魚，實驗結果表明隨著發酵過程的進行，海鱸魚中的大量蛋白質發生降解，雖發酵初期降解效果不明顯，但發酵60 h后PV的IgG、IgE結合能力分別下降了26.9%、22.3%，IgG、IgE結合能力的變化與PV空間結構的變化有密不可分的關系。傅玲琳等[39]通過體外實驗研究5 種乳酸菌對小鼠致敏性的影響差異，發現其中芽孢乳酸菌 09.712對小鼠的抗過敏能力最強，利用體內檢測法測定芽孢乳酸菌09.712治療前后的致敏小鼠血清中特異性抗體、脾臟T淋巴細胞亞群等的含量變化，研究乳酸菌緩解食物過敏的免疫調節機理，結果表明，Th0細胞的分化受到芽孢乳酸菌的調控，它有利于Th1和Treg細胞的生成，而Th2細胞的生成受到抑制，IFN-γ等抗炎因子分泌量激增并被大量表達出來，這樣有利于調節Th1/Treg/Th2的動態免疫平衡，從而減少過敏原對小鼠腸黏膜的刺激，這可能是其抑制過敏反應的機理之一。由此可見，乳酸菌不僅可以將大分子蛋白降解為小分子肽或氨基酸，還可以通過改善腸道菌群的失衡狀態，調節炎癥因子的釋放，增強機體對外來致敏食物的免疫力，進而改善機體的過敏癥狀。

2.3 基因改良

基因改良技術是近年來迅速發展起來的一項新型生物技術,這項技術從生物遺傳學的角度出發，聚焦于引發過敏反應的源頭物質，通過改良或消除關鍵抗原表位的編碼基因，使改良后的編碼基因不能按照原先的方式參與蛋白表達過程，從而影響其致敏性。有研究表明, 反義技術可以達到改良或消除抗原表位的編碼基因的目的，如首先在體外人工合成一條短鏈RNA，然后將其導入體內，它會對同源互補 mRNA起到降解作用，因此致敏基因會發生改變。另一種方法的原理為體內特異性基因的表達被人工導入的基因片段所抑制，這兩種方法都可以改良致敏蛋白的編碼基因，進而影響其致敏性[40]。

REESE等[41]通過誘發突變實驗改變蝦過敏原的表位組成，消減其致敏性，首先采用測試分析手段選定了5個可以識別IgE反應的關鍵致敏表位以及幾個對IgE Ab結合能力具有較大影響的氨基酸位置，在此基礎上，利用非過敏性脊椎動物的原肌球蛋白把蝦過敏原的IgE識別肽替換掉，測試替換前后它們與IgE Ab的反應能力差異，然后將其關鍵IgE表位斷開，再重新組合一個新的蛋白VR9-I，結果發現誘變后的過敏原蛋白的氨基酸序列出現變化，免疫反應性明顯降低，致敏性降低了98%；WAI等[14]通過定點誘變和表位缺失兩種技術方法改變TM的表位組成與結構，結果顯示，當TM已知的8個表位被除去或者被魚的相應氨基酸序列替換后，TM致敏性會發生明顯變化。由此可見，基因改良技術可以將過敏原的關鍵致敏表位破壞或者改變，表位致敏性發生變化，且基因改良技術通過改變過敏原的線性表位和構象表位組成比例，產生新的氨基酸序列，影響了抗原表位的表達過程[42]，從而達到改變致敏性的目的。

3 各生物加工技術對過敏原消減作用的比較

目前已知的用于消減過敏原致敏性的生物加工技術的優缺點見表2。酶改性技術反應條件溫和, 不會損壞食品中的其他物質特別是營養元素, 還有可能產生一些具有特殊生理功能的活性肽，但酶改性效果受到酶種類、酶改性條件等因素的共同影響, 因此可能會產生一些降低食品風味體驗的物質，如苦味肽；微生物發酵法降低食物致敏性并不是適合于所有的過敏食物，但發酵處理后的食品，營養成分不會被破壞，還有助于各類營養物質被人體最大程度化吸收；基因改良技術可以改變抗原表位組成，高效消減過敏原致敏性，但可能會引入新的抗原決定簇，誘導機體產生其他不良反應；聯合技術雖消減過敏原致敏性的效率很高，但操作較復雜，且可能會影響風味。

表2 生物加工技術對致敏蛋白消減作用比較Table 2 Comparison of the reduction effect of bioprocessing technology on allergenic proteins

4 展望

隨著水產品市場的不斷擴大，食物過敏反應日趨嚴重和復雜，因此水產品過敏原致敏性的消減受到越來越多學者的關注。但目前的研究主要集中在采用不同食品加工技術消減硬骨魚類及甲殼類水產品中過敏原的致敏性，對其消減機理的研究較少，且涉及到機理研究的多為物理和化學消減方法，而生物加工技術對過敏原致敏性的消減機理研究甚少。因此，在今后的研究中，有必要深入研究生物加工技術對過敏原致敏性的消減作用機制，如生物加工技術影響過敏原致敏性的作用方式，生物加工技術消減過敏原致敏性的過程中，過敏原結構具體發生了哪些變化，哪些抗原表位遭到了破壞，關鍵致敏表位是否發生改變，表位變化與其氨基酸序列組成有何關系，結構變化及表位變化與致敏性變化的構效關系。此外，在之后的研究中，我們應該將目前成熟的生物消減技術更多的利用在軟體動物致敏性的消減研究中，為今后利用生物加工技術開發低致敏性水產加工食品提供理論支撐。