分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測中的應用現狀、技術制約因素與發展趨勢

丁衛平，楊夕宇，朱可瀅，蔡雙鳳*

(1.濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濱州 256600；2.華僑大學 生物醫學學院/醫學院，福建 廈門 361021)

食源性疾病的暴發與食品受食源性微生物污染密切相關。據文獻報道，在食源性疾病疫情中，由微生物引起的暴發事件起數和發病人數最多[1]。 不僅如此，從食品安全長遠發展來看，農獸藥殘留以及非法添加物等食品安全問題是國民經濟發展到特定階段必然出現的問題, 也會隨著國民經濟的發展和農業生產方式的轉變而弱化，但是致病微生物卻將長期存在，并將是國民經濟進一步發展后食品安全的主要問題[2]。要保障食品安全，離不開食品中微生物的精準檢測。出于對食品中微生物可能引起的食品安全問題的擔憂，人們一直在研究食品微生物檢測的相關技術，分子生物學相關技術就是研究的重點之一[3-4]。下面首先對分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測中的應用現狀進行總結。

1 分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測領域的應用現狀

根據國家食品安全監督抽檢實施細則要求，我國目前各檢測機構一般采用國家標準來檢測判定食品中的微生物[5]。從當前的食品微生物檢測國家標準來看，對于致瀉大腸埃希氏菌的檢驗，GB 4789.6-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》要求[6]，生化反應符合大腸埃希氏菌特征的菌落需要進行PCR確認試驗；GB 4789.12-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》要求[7]，對于肉毒梭菌的檢驗，生化反應符合肉毒梭菌的菌落需要進行毒素基因檢測，以確定肉毒梭菌具體類型；對于大腸埃希氏菌O157:H7/NM毒力基因的測定，GB 4789.36-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》中規定此項檢驗屬于選做項目[8]；對于諾如病毒的檢測，GB 4789.42-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 諾如病毒檢驗》則要求采用實時熒光RT-PCR方法檢測[9]。

以上是采用分子生物學技術進行微生物檢驗的強制性國家標準，如果把采用分子生物學技術進行檢驗的標準拓展到推薦性國家標準、行業標準、地方標準，那么采用分子生物學技術的標準數量將大大增加，這些標準用到的分子生物學技術有常規PCR、熒光定量PCR、數字PCR、基因芯片等。

出入境檢驗檢測機構由于要與國際接軌，因此其對新技術的運用要超前一些，采用分子生物學技術進行檢驗的行業標準數量也比較多。對于國內檢測機構來說，從GB 29921-2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》以及歷年的國家食品安全監督抽檢實施細則中可以看出[10]，當前的食品檢測中，致病菌檢測的重點是沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及大腸埃希氏菌 O157:H7。大腸埃希氏菌O157:H7/NM毒力基因的測定由于屬于選做項目，檢測機構做的比較少。其他重點檢測的致病菌基本都按照國家標準使用傳統的檢測方法包括增菌培養篩選及后續計數檢測、生化反應鑒定或血清學鑒定等環節，沒有使用分子生物學技術。因此，雖然分子生物學技術在食品微生物檢測中的研究日益走向深入，但是分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測中的應用仍然比較少。

2 分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測領域應用的技術制約因素

隨著檢驗要求的提升和檢驗規模的擴大，食品微生物傳統檢測方法的缺點日益凸顯，如由于不可培養微生物的存在，僅依靠培養手段，在生物多樣性上不能反映微生物的真實狀況以及檢測周期長、檢測流程復雜、特異性不足等缺點[11]。盡管存在這些缺點，但是新的技術并未完全取代原有的技術，這是因為新的技術也存在各種缺點。在一種技術的優越性未得到完全確認時，出于對食品安全的負責，監管部門不得不繼續要求檢測機構采用原有的較為成熟的技術。制約分子生物學技術在食品微生物檢驗中應用的因素有很多，下面僅對相關技術制約因素進行簡單總結。

2.1 微生物死活的有效區分

與傳統的微生物檢驗方法相比，采用分子生物學技術進行微生物檢驗可實現對不可培養微生物的鑒定，在這方面科學家進行了大量的研究并取得了一定的成果[12-13]。這是采用分子生物學方法進行微生物檢驗的優點之一，但采用此方法進行微生物檢驗同樣存在不足之處，比如在食品微生物檢驗中應用最多的分子生物學技術是PCR技術，采用PCR技術檢測食品微生物的主要缺陷是不能區分微生物的死活，從樣品中提取的微生物即使死掉其DNA同樣能作為模板進行特異性擴增, 因此在檢測過程中會出現假陽性結果。開發快速、準確的活菌檢測技術是食品微生物檢測領域的一大挑戰。當前國內外一些科學家在開發利用PMA/EMA-PCR技術，根據他們的文章報道[14-15]，這項技術能消除死去的微生物對PCR擴增的影響, 使擴增信號只來源于活的微生物，近年來這項技術已經開始進行探索性應用，但由于PMA(疊氮溴化丙錠)、EMA(疊氮溴化乙錠)毒性較大，污染消除也比較困難，大規模推廣應用難度較大。

2.2 微生物難以有效富集的缺點

如果想利用分子生物學技術對食品中的微生物進行快速檢測，菌體的富集分離技術必不可少。當前的菌體富集分離技術有離心分離技術、改良增菌培養基富集技術、膜分離技術及免疫磁性分離技術等，但這些方法大都存在一定的缺點。離心分離技術存在著粘附食品基質、大量細菌損失等缺點[16]。高質量的改良增菌培養基的研發比較困難。采用膜分離技術時分離后的菌體常濃縮于食品或濾膜上，還需要進一步洗脫和分離，并且洗脫效果嚴重影響著細菌的回收率[17]。使用免疫磁性分離技術時，由于食品基質復雜，微生物菌群復雜多樣，對于抗體的干擾較大，選擇的抗原靶標不特異，將導致富集到很多雜菌，無法正確檢測到目標菌[18]。同時免疫磁性分離技術存在著成本高、需要預處理、不適合大體積樣品分離等缺點。

2.3 微生物定量的缺點

微生物所造成的毒害作用不但與其類型有關，也與其數量密切相關，GB 29921-2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》對于食品中致病菌的限量都做了相關規定。因此，在進行食品微生物檢測時，需要比較準確地檢測食品中微生物的數量，而這恰恰是PCR等傳統分子生物學技術的缺點之一。不過現在隨著分子生物學技術的快速發展，科學家創造性地發明了數字PCR技術，這種技術是對起始樣品的絕對定量，利用這種技術可以使得基于 PCR 技術的食源性微生物的檢測真正成為定量檢測[19]。但在當前，數字PCR檢測的成本仍然比較高，相關技術更多地用于科學研究，在檢測機構推廣難度較大。

3 分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測領域的發展趨勢

3.1 傳統鑒定技術與分子生物學技術相結合

實際上，現在利用分子生物學技術進行檢驗的國家標準基本就是將傳統鑒定技術與分子生物學技術相結合，比如致瀉大腸埃希氏菌、肉毒梭菌的檢驗。這些微生物的檢驗一般都是先進行增菌、生化反應鑒定然后再進行分子生物學鑒定，傳統的涂布平板法可以比較準確地對微生物數目進行定量，而分子生物學技術則可以對微生物進行快速定性，但在定量方面仍然存在不足，這種檢驗方法的好處是可以將兩種技術的優勢結合起來，這也是未來分子生物學技術用于食品微生物檢驗的發展趨勢之一。

3.2 進一步挖掘現有技術的潛力

如果能將現有技術的潛力進一步發掘，可能會產生巨大的應用價值。比如數字PCR技術，這項技術具有能對樣品DNA絕對定量的獨特優勢，但當前的一個缺點就是價格太高，這大大限制了其應用。如果隨著科技的進步，這項技術的成本能夠降下來，那么此項技術的應用范圍會大大增加。再比如，如果能夠將PMA等染料與數字PCR技術相結合，則能夠實現對活菌的絕對定量。除此之外，微流控芯片、全自動PCR技術、液相芯片等技術也已經展現出了各自的獨特優勢[20-22]，需要進一步發掘這些技術的潛力加以推廣應用。

3.3 新技術的開發利用

要利用分子生物學技術對食品中的微生物進行檢測，一些配套的技術也必不可少，如增菌培養富集技術、DNA提取技術、菌體直接富集分離技術等，這些技術與最后的檢測結果密切相關。當前這些技術都有很大的發展空間，需要科學家們進行進一步的研究。如果我們能夠開發出高效率的沒有前增菌過程的菌體富集分離技術，再配套分子生物學技術，就可以真正實現食品微生物的快速檢測，這在發生食品安全事件時顯得特別重要，可以使我們更快地確定病原體。

4 展望

任何一種技術都有其缺點，但科學就是在不斷發現問題與解決問題中不斷取得進步。分子生物學技術作為當前生物學領域發展最快、應用最廣泛的領域，已經在食源性病毒如諾如病毒的檢測中起著不可替代的作用，理應也能夠在食品微生物檢測領域發揮更大的作用。隨著分子生物學技術及其他技術的發展，食品微生物檢測技術必將迎來廣闊的發展空間。