荊州地區(qū)霉豆渣真菌多樣性研究

劉夢(mèng)琦，朱媛媛，倪慧，王玉榮，郭壯

(湖北文理學(xué)院,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽, 441053)

豆渣又名豆腐渣，是豆腐、豆奶和腐竹等生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品[1]。新鮮豆渣含水量高、豆腥味重、口感粗糙、難以貯存且干燥成本高，因而應(yīng)用率較低，造成了一定的環(huán)境問題和資源浪費(fèi)[2]。豆渣中含有豐富的膳食纖維、礦物質(zhì)和維生素等成分，可為部分微生物菌株的生長(zhǎng)提供必要的營養(yǎng)需求，同時(shí)微生物的生長(zhǎng)亦可改善豆渣的口感，并在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種活性物質(zhì)和酶系[3]。我國是豆制品的生產(chǎn)和消費(fèi)大國，因而利用微生物發(fā)酵開發(fā)豆渣產(chǎn)品是極為必要的[4]。

霉豆渣又名豆渣粑，是以豆渣為原料經(jīng)微生物發(fā)酵制作而成的地方特色發(fā)酵食品，在我國湖北省、湖南省和江西省具有一定的分布，其中湖北省主要分布在荊州和洪湖地區(qū)[5]。近年來，國內(nèi)研究人員圍繞霉豆渣微生物多樣性解析開展了系列研究，張燕鵬等[6]對(duì)江西省瑞金地區(qū)霉豆渣微生物類群解析發(fā)現(xiàn)，其真菌主要隸屬于串珠霉屬(Monilia)、根霉屬(Rhizopus)和酵母屬(Saccharomyces)，細(xì)菌主要隸屬于微球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、片球菌屬(Pediococcus)和異常球菌屬(Deinococcus)。毛欣欣[7]研究發(fā)現(xiàn)湖南省邵陽地區(qū)霉豆渣細(xì)菌類群主要為克羅諾桿菌屬(Cronobacter)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和Staphylococcus，真菌類群主要為Rhizopus和絲孢酵母屬(Trichosporon)。由此可見，不同地區(qū)制作的霉豆渣其微生物群落結(jié)構(gòu)可能存在一定的差異，然而目前關(guān)于湖北省霉豆渣微生物類群的研究鮮見報(bào)道。

作為近年來較為流行的第二代高通量測(cè)序技術(shù)，Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)具有成本低、通量高和結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛地應(yīng)用于豆豉[8]、豆瓣醬[9]、醬油[10]和腐乳[11]等發(fā)酵食品的微生物多樣性解析中。本研究采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)湖北省荊州地區(qū)下轄的監(jiān)利市和石首縣所產(chǎn)霉豆渣真菌多樣性進(jìn)行了比較分析，明確了2 個(gè)縣市所產(chǎn)霉豆渣真菌多樣性的共性及差異，并對(duì)造成差異的真菌類群進(jìn)行了甄別，以期為后續(xù)以霉豆渣為代表的地方特色發(fā)酵豆制品的產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霉豆渣：采集自湖北省荊州地區(qū)下轄的監(jiān)利市容城鎮(zhèn)(E112°35′～113°19′，N29°26′～30°12′)和石首縣高陵鎮(zhèn)(E112°43′～112°47′，N29°67′～29°85′)，2個(gè)采樣點(diǎn)間的直線距離約為60 km。

引物SSU0817F/SSU1196R，武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；5×FastPfuBuffer、dNTPs Mix、FastPfuFly DNA Polymerase，寶生物工程大連有限公司；基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PE300高通量測(cè)序平臺(tái)，美國Illumina公司；CR21N高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)，美國Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀，美國ABI公司；Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國ProteinSimple公司；R930機(jī)架式服務(wù)器，美國DELL公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

2019年11月于湖北省荊州地區(qū)下轄的監(jiān)利市和石首縣采集農(nóng)家自制的霉豆渣樣品各4份，編號(hào)為JL1～JL4和SS1～SS4。樣品采集時(shí)，霉豆渣的制作時(shí)間在10～15 d，顏色一般為白色不帶有黑色或綠色的斑點(diǎn)，略帶醬臭味但不刺鼻，其制作工藝大體分為清漿、壓榨、蒸料、再次壓榨、攤晾、篩勻、成型和霉制等8 個(gè)流程。將采集的樣品放入采樣箱中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分裝，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 樣品微生物宏基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

按DNA提取試劑盒中的步驟進(jìn)行DNA提取，使用分光光度計(jì)進(jìn)行檢驗(yàn)，置于-20 ℃暫存?zhèn)溆谩Ｒ院细竦腄NA為模板，SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和SSU1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)為引物，參照周書楠等[12]的方法對(duì)真菌18S rRNA V4～V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將合格的擴(kuò)增產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用PE300高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

序列下機(jī)后，參照郭壯等[13]的方法對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控，剔除錯(cuò)配的序列并進(jìn)行篩選得到合格的序列集。利用QIIME分析平臺(tái)[14]，對(duì)合格的序列進(jìn)行分析，繼而對(duì)序列使用PyNAST軟件[15]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)和對(duì)齊，之后使用2步UCLUST法在100%和97%的相似度下進(jìn)行劃分[16]，構(gòu)建分類操作單元矩陣(operational taxonomic units，OTU)，最后使用SILVA數(shù)據(jù)庫[17]對(duì)真菌 OTU 代表性序列進(jìn)行同源性比對(duì)。在繪制系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香濃指數(shù)等α多樣性指標(biāo)進(jìn)行分析，然后基于UniFrac距離使用加權(quán)組平均法(weighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚類和主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)對(duì)2 個(gè)縣市霉豆渣樣品真菌類群進(jìn)行β多樣性解析。

1.3.4 多元統(tǒng)計(jì)分析及圖表繪制

應(yīng)用多元方差分析(multivariate analysis of variance，MANOVA)對(duì)2 個(gè)縣市霉豆渣樣品真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性進(jìn)行分析，使用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)分析對(duì)關(guān)鍵真菌類群進(jìn)行甄別。使用R軟件(v4.0.2)的waterfall軟件包繪制瀑布圖，使用Origin 2017繪制其他圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

本研究的8 個(gè)霉豆渣樣品經(jīng)質(zhì)控后得到216 309條高質(zhì)量的序列，平均每個(gè)樣品27 039條。經(jīng)2步UCLUST劃分后，監(jiān)利市4 個(gè)霉豆渣樣品OTU的數(shù)量分別為693、753、807 和770 個(gè)，石首縣的分別為838、847、446和368 個(gè)。使用折線圖對(duì)2 個(gè)縣市樣品的α多樣性進(jìn)行比較分析，進(jìn)而判斷本研究測(cè)序深度是否滿足后續(xù)分析的要求。

由圖1-a可知，當(dāng)測(cè)序量達(dá)到近40 000 條時(shí)，稀釋曲線尚未進(jìn)入平臺(tái)期，說明隨著測(cè)序深度的增加霉豆渣中新的真菌物種會(huì)進(jìn)一步被發(fā)現(xiàn)。由圖1-b可知，當(dāng)測(cè)序量達(dá)到5 000 條時(shí)，香農(nóng)指數(shù)曲線已經(jīng)進(jìn)入平臺(tái)期，這說明本研究的測(cè)序深度已可完全捕獲霉豆渣中真菌類群的生物學(xué)信息。由此可見，本研究的測(cè)序深度是符合后續(xù)分析要求的。

本研究中樣品的最小測(cè)序深度為10 010條序列。在該測(cè)序深度下，監(jiān)利市4個(gè)霉豆渣樣品的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為390、341、393和391，香濃指數(shù)為3.44、3.10、3.28和3.36；石首縣各樣品的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為357、346、170和348，香濃指數(shù)為2.98、2.75、0.90和2.89。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采集自監(jiān)利市的霉豆渣真菌類群的香濃指數(shù)顯著偏高(P<0.01)，而兩者發(fā)現(xiàn)物種數(shù)差異不顯著(P>0.05)。由此可見，采集自監(jiān)利市的霉豆渣真菌多樣性要顯著高于石首縣(P<0.01)。

a-稀釋曲線；b-香農(nóng)指數(shù)曲線圖1 稀釋曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.1 Rarefaction curves and shannon index curves

2.2 基于門和屬分類學(xué)地位的真菌類群分析

本研究將平均相對(duì)含量>1.00%的真菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢(shì)門或?qū)伲瑢⑵渌?1.00%的門或?qū)贇w并為“其他”(others)，將不能鑒定到門或者屬水平的序列歸并為“不可鑒定”(unclassified)。基于門水平2 個(gè)縣市霉豆渣真菌類群的比較分析如圖2所示。

圖2 基于門水平2 個(gè)縣市霉豆渣真菌類群的比較分析Fig.2 Comparative analysis of fungal groups of Meitauza from Jianli city and Shishou county at the phylum level

由圖2可知，所有霉豆渣樣品中真菌類群可鑒定為3 個(gè)門，分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和毛霉門(Mucoromycota)，平均相對(duì)含量分別為57.77%、33.54%和8.00%，有0.69%的序列無法鑒定到門水平。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采集自2 個(gè)縣市的霉豆渣樣品在門水平上真菌類群差異均不顯著(P>0.05)。

本研究中的所有序列可鑒定為32 個(gè)真菌屬，其中平均相對(duì)含量>1.00%的有5 個(gè)，其相對(duì)含量如圖3所示。

圖3 基于屬水平2 個(gè)縣市霉豆渣真菌類群的比較分析Fig.3 Comparative analysis of fungal groups of Meitauza from Jianli city and Shishou county at the genus level

由圖3可知，5 個(gè)平均相對(duì)含量>1.00%的真菌屬分別為鐮刀霉屬(Fusarium)、Trichosporon、籃狀菌屬(Talaromyces)、放射毛霉屬(Actinomucor)和枝孢屬(Cladosporium)，平均相對(duì)含量分別為34.60%、28.96%、12.51%、7.27%和1.55%。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)縣市霉豆渣中僅Fusarium含量差異非常顯著(P<0.01)，其在監(jiān)利市和石首縣樣品中的平均相對(duì)含量分別為56.74%和12.45%。

Fusarium和Trichosporon為監(jiān)利市各樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，平均相對(duì)含量分別為56.74%和17.40%，樣品JL1和JL2中亦存在一定量的Actinomucor，相對(duì)含量分別為7.46%和11.02%。采集自石首縣的霉豆渣樣品存在一定的差異性，其中Fusarium和Trichosporon為樣品SS1、SS2和SS4中的優(yōu)勢(shì)菌，其平均相對(duì)含量分別為16.52%和51.65%，而樣品SS3中優(yōu)勢(shì)真菌屬為Talaromyces，相對(duì)含量達(dá)到88.39%。此外，較之樣品SS2和SS4，樣品SS1中還含有一定量的Actinomucor，相對(duì)含量為31.83%。由此可見，采集自石首縣的霉豆渣真菌類群組間差異性可能要大于監(jiān)利市。

研究表明，F(xiàn)usarium和Talaromyces具有一定的致病性，Talaromyces可能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[18]和肺炎[19]等疾病，而Fusarium可能引起皮膚或呼吸道的感染[20]。有研究表明霉豆渣主要依靠毛霉菌進(jìn)行發(fā)酵，管瑛[21]從湖北省黃石市陽新縣霉豆渣中分離出了隸屬于毛霉科(Mucoraceae)的雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)。本研究發(fā)現(xiàn)Actinomucor僅為部分霉豆渣樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，其在樣品JL3和SS2中的相對(duì)含量均<1.00%，而在樣品SS3中根本不存在。由此可見，霉豆渣樣品的真菌類群整體上是存在較大差異的，究其原因可能在于霉豆渣含水量較高、營養(yǎng)物質(zhì)豐富且制作方式為開放式發(fā)酵，多種真菌均可以其為基質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)，因而環(huán)境、制作工具及豆渣本身攜帶的微生物直接決定了最終產(chǎn)品中的真菌類群構(gòu)成。由于發(fā)酵環(huán)境的開放性和發(fā)酵條件的不可控，霉豆渣的生產(chǎn)受外界影響較大且存在一定的食用安全隱患，因而在后續(xù)研究中積極分離、鑒定和篩選具有較高食用安全性和優(yōu)良發(fā)酵特性的Actinomucor菌株，并將其用于霉豆渣的生產(chǎn)具有積極的意義。

2.3 基于OTU水平的真菌類群分析

在97%的相似度下，本研究將序列劃分到了3 918 個(gè)OTU，若某一OTU在8 個(gè)樣品中均存在，則定義其為核心OTU，相對(duì)含量如圖4所示。

圖4 基于OTU水平的2 個(gè)縣市霉豆渣真菌核心類群Fig.4 Fungal core groups of Meitauza from Jianli city and Shishou county at the OTU level

由圖4可知，核心OTU共有10 個(gè)，僅占總OTU數(shù)量的0.26%，但包含的序列數(shù)占總序列的59.56%。OTU1 366被鑒定為Trichosporon，平均相對(duì)含量為27.50%；OTU2 599、OTU2 028、OTU1 846、OTU963和OTU1 206被鑒定為Fusarium，其中OTU963的平均相對(duì)含量高達(dá)29.08%；而其他4 個(gè)OTU均鑒定不到屬水平，累計(jì)平均含量?jī)H為0.29%。這也進(jìn)一步證實(shí)了，F(xiàn)usarium和Trichosporon為采集自監(jiān)利市和石首縣多數(shù)霉豆渣樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌類群。

本研究發(fā)現(xiàn)有20 個(gè)OTU在監(jiān)利市4 個(gè)霉豆渣樣品中均存在，但在石首縣樣品中均不存在，其累計(jì)包含序列僅占總序列數(shù)的0.69%，且均鑒定不到屬水平。沒有發(fā)現(xiàn)有OTU僅存在于石首縣4個(gè)霉豆渣樣品中，而在監(jiān)利市樣品中不存在。

2.4 β多樣性分析

本研究進(jìn)一步采用基于UniFrac距離的UPGMA聚類和PCoA對(duì)2 個(gè)縣市霉豆渣真菌類群的β多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖5所示。

a-基于聚類分析；b-主坐標(biāo)分析圖5 基于聚類分析和主坐標(biāo)分析的2個(gè)縣市霉豆渣真菌類群β多樣性分析Fig.5 Analysis of beta diversity of fungal groups in Meitauza from Jianli city and Shishou county using cluster analysis and principal coordinate analysis

由圖5-a可知，監(jiān)利市4個(gè)樣品形成一個(gè)聚類，石首縣樣品SS2和SS4可單獨(dú)形成一個(gè)聚類，雖SS1和SS3與該地區(qū)其他2個(gè)樣品無法形成一個(gè)分支，但2個(gè)縣市霉豆渣形成了明顯的聚類趨勢(shì)。由圖5-b可知，監(jiān)利市樣品主要分布在第一和第四象限，而石首縣樣品主要分布在第二、三和四象限。由此可見，不同縣市制作的霉豆渣樣品其真菌類群呈現(xiàn)出一定的差異。在提取PCoA前85%因子的基礎(chǔ)上，本研究采用MANOVA分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)縣市霉豆渣樣品真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異(P<0.05)。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)湖南省湘西土家族苗族自治州龍山縣和湖北省宜昌市當(dāng)陽市的豆豉[22]及湖北省恩施土家族苗族自治州咸豐縣和湖北省宜昌市當(dāng)陽市的辣椒醬[23]細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，亦發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，究其原因可能在于生態(tài)環(huán)境和制作工藝的不同會(huì)對(duì)發(fā)酵食品微生物類群的形成產(chǎn)生一定影響。大量研究表明，不同地區(qū)特殊發(fā)酵食品中蘊(yùn)含了較為豐富和獨(dú)特的微生物類群，對(duì)其進(jìn)行挖掘、保藏和篩選，對(duì)我國特色發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)和使用安全性提升均具有積極的意義[24]。

由圖5-a可知，監(jiān)利市樣品JL1和JL2，JL3和JL4兩兩形成一個(gè)分支且在樹的末端，這說明4個(gè)樣品的真菌類群較為相似；而石首縣樣品SS3和SS1的分支相對(duì)較長(zhǎng)，這說明這2個(gè)樣品真菌類群與其他樣品存在較大差異。由圖5-b可知，較之監(jiān)利市樣品，石首縣樣品空間分布更為分散。由此可見，采集自石首縣的霉豆渣真菌類群組間差異性可能要大于監(jiān)利市，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了圖3的結(jié)論。本研究進(jìn)一步對(duì)2 個(gè)縣市樣品真菌類群的組間差異進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 兩個(gè)縣市霉豆渣真菌類群的組間差異性分析Fig.6 Intergroup difference analysis of fungal groups in Meitauza from Jianli city and Shishou county注：*表示兩者差異顯著(P<0.05)

由圖6可知，采集自監(jiān)利市霉豆渣樣品真菌類群的組間距離為0.039±0.002，而石首縣為0.107±0.206，且經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩者差異顯著(P<0.05)。由此可見，采集自石首縣的霉豆渣真菌類群組間差異性大于監(jiān)利市。

2.5 關(guān)鍵真菌類群甄別

本研究進(jìn)一步采用LEfSe分析對(duì)導(dǎo)致2 個(gè)縣市霉豆渣真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的類群進(jìn)行了甄別，結(jié)果如圖7所示。

圖7 基于LEfSe分析2 個(gè)縣市霉豆渣關(guān)鍵真菌類群的甄別Fig.7 Identification of key fungal groups in Meitauza from Jianli city and Shishou county by LEfSe analysis

由圖7可知，導(dǎo)致2 個(gè)縣市霉豆渣真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的類群隸屬于雙足囊菌科(Dipodascaceae)的耐堿酵母屬(Galactomyces)，其在采集自監(jiān)利市樣品中的相對(duì)含量為1.46%，而在石首縣樣品中僅為0.62%，為非優(yōu)勢(shì)菌屬。值得一提的是，除Galactomyces外并未發(fā)現(xiàn)其他類群導(dǎo)致2個(gè)縣市霉豆渣真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。由此可見，正是由于部分相對(duì)含量較少的真菌類群存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致了采集自2個(gè)縣市的霉豆渣真菌群落結(jié)構(gòu)的不同。

3 結(jié)論

湖北省荊州地區(qū)霉豆渣中的優(yōu)勢(shì)真菌類群以Fusarium、Trichosporon、Talaromyces、Actinomucor和Cladosporium為主。雖然荊州地區(qū)下轄的監(jiān)利市和石首縣制作的霉豆渣具有大量的核心真菌類群，但采集自2 個(gè)地區(qū)的樣品真菌類群存在顯著的差異，且該差異主要是由Galactomyces等非優(yōu)勢(shì)真菌類群導(dǎo)致的。