濃香型白酒窖泥放線菌的原位分離及代謝特性研究

羅碧霞，鄭若欣，程鐵轅，任志強，衛春會，鄧杰，黃治國*

1(釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室(四川輕化工大學)，四川 宜賓，644000)2(四川國檢檢測有限責任公司， 四川 瀘州，646000)3(宜賓海關，四川 宜賓，644000)

濃香型白酒的生產以泥窖窖池為基礎，不同窖齡的窖池有著不同的微生物群落結構[1-2]。窖泥中棲息著種類多樣、數量豐富的微生物，這些微生物隨著窖池的使用不斷得到馴化，進而構成了獨特的微生態區系，這些微生物的群落結構和演替影響著白酒的質量[3-4]。酒醅為窖泥中的微生物提供其生長所需的碳源、氮源、生長因子等各類營養物質，窖泥中的微生物則生長代謝產生己酸、乳酸、丁酸、乙酸等酸類，進一步在窖泥或酒醅中酯化酶的作用下生成各種酯類[5-6]。濃香型白酒主體香味成分己酸乙酯的生成與窖泥微生物有最直接的關系，研究窖泥微生物意義重大。據相關資料[7]表明，窖泥微生物的研究主要包含酵母菌、霉菌、細菌、放線菌，相對而言，放線菌的相關研究較少，其中有關濃香型白酒釀造環境中放線菌的研究還遠遠不夠[8]。王濤等[9]對濃香型白酒釀造相關放線菌發酵液中的主要醇溶性和水溶性揮發性產物進行GC-MS分析發現代謝產物有醇類、酯類、醛類、酸類。周敬波等[10]對放線菌的產酶能力進行研究，發現實驗菌株具有很強產淀粉酶、產蛋白酶能力。郭威等[11]發現放線菌的產酶能力與其促己酸菌產己酸能力是有一定關聯的。這些研究都表明了放線菌在白酒生產中具有較高的可研究前景和可開發價值。

對于窖泥放線菌研究來說，多采用直接從窖池取回窖泥進行篩菌工作，可以直觀地獲得該時期該窖泥中的微生物，但是會大概率無法分離得到放線菌，可能是由于所取樣品無放線菌或者放線菌在該時期的生存能力較弱導致的難以篩選，針對于這一不足，利用細菌不能產生菌絲，就無法透過濾膜進入原位培養基中，絲狀真菌菌絲體較粗，同樣會被濾膜阻隔，酵母菌不產生菌絲，菌體也較大，因而也不能透過濾膜，只有放線菌可穿過濾膜這一原理，自制原位培養裝置，埋放于窖泥中富集放線菌。原位培養(in situ cultivation)可以模擬自然環境，富集菌體，有利于提高微生物，特別是某些未培養微生物(uncultivated microorganisms)的獲取率[12-13]。

本試驗通過高通量測序技術對窖泥細菌群落結構進行分析，進一步對放線菌多樣性進行分析，篩選分離出放線菌，以系統發育特征及生理生化特征對菌株進行鑒定，并對其相關耐受性和代謝特性進行研究，為探究放線菌在窖泥中的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品

窖泥取自川南某濃香型白酒生產企業一口50年窖齡且發酵正常的窖池。

1.2 主要試劑

KNO3、NaCl、KH2PO4、葡萄糖、重鉻酸鉀(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠；酵母膏、麥芽浸粉、蛋白胨(均為生物試劑)，北京奧博星生物技術有限責任公司；結冷膠(食品級)，鄭州市中成化工。

1.3 儀器與設備

DM500生物顯微鏡，德國Leica公司；C1000 Touch PCR儀、ChemiDocXPS+凝膠成像系統，美國BIO-RAD公司；5430離心機，Eppendorf公司；固相微萃取頭(50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS)，美國Supelco 公司；5975B-7890A氣相色譜質譜聯用儀，安捷倫科技中國有限公司。

1.4 培養基

原位培養基：黃水1 L，瓊脂粉1.5%(質量分數)，結冷膠0.5%(質量分數)，自然pH值。

純化培養基：高氏Ⅰ號培養基[14]。

YEME培養基：葡萄糖10 g，蔗糖100 g，蛋白胨5 g，麥芽浸粉3 g，酵母膏3 g，蒸餾1 L，滅菌后加MgCl2(2.5 mol/L) 2 mL，滅菌條件為121 ℃，15 min。

以上培養基所用無機鹽均為水合鹽，下同，均添加1%瓊脂和0.5%的結冷膠做凝固劑[15-16]，添加75 μg/mL的重鉻酸鉀[17]，5 mL/L的黃水，調節pH 7.0～7.4，均在121 ℃下滅菌15 min。

燕麥汁培養基：生燕麥片20 g，可溶性淀粉10 g，微量鹽溶液1 mL(FeSO40.1%，MgCl20.1%，ZnSO40.1%)(質量分數)，自然pH值，滅菌條件為121 ℃，15 min。

固態發酵培養基：燕麥粉50 g，微量鹽溶液1 mL(KNO31%、KH2PO40.5%、MgSO40.5%，FeSO40.1%，NaOH 0.8%)(質量分數)，pH自然，滅菌條件為121 ℃，15 min。

1.5 窖泥中微生物群落結構分析

取中、下、底3個空間位置的窖泥，3點取樣，混合均勻，取回冷凍。送往上海美吉生物醫藥科技有限公司，采用通用引物968FMID-1401R，參照鄧杰等[18]的方法完成高通量測序工作，對測序數據利用Mother軟件進行分析，結果采用平均值±標準誤差的形式表示。

1.6 放線菌的分離純化與鑒定

1.6.1 放線菌的分離純化

參照姜明國等[19]分離紅樹林根際土壤放線菌所用原位培養裝置(圖1-a)與閆志英等[20]發明的一種原位分離產纖維素酶放線菌的裝置，自制原位培養裝置(圖1-b)。將其分別埋放在窖底和窖壁下層泥下1 cm左右，約70 d后取回搗碎，稱取10 g加入90 mL 0.85%(質量分數)無菌生理鹽水，振蕩均勻，靜置2 h后梯度稀釋至10-1、10-2、10-3，涂布至高氏I號培養基，28 ℃恒溫培養5 d，每個稀釋度3組平行。挑取具有放線菌典型菌落形態特征的單菌落[21]，純化培養2～3次，最后以試管斜面-4 ℃保藏備用。

a-放線菌原位俘獲裝置；b-自制原位培養裝置圖1 原位培養裝置Fig.1 The chamber of in situ cultivation

1.6.2 放線菌的初步鑒定

參照《放線菌系統分類技術》[21]用插片法并滴加美藍染液觀察菌體形態，并進行明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、纖維素分解、硝酸鹽還原、H2S的產生這6組生理生化試驗。

1.6.3 放線菌DNA提取、擴增及測序

利用土壤基因組DNA提取試劑盒(康為世紀)提取放線菌DNA，采用細菌16S rRNA基因擴增通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，參照張洪偉等[22]的反應體系，進行PCR擴增。將PCR反應產物送上海杰李生物技術有限公司進行純化和測序。在NCBI官方網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行序列同源性比對，采用 MEGA 7.0構建系統發育樹，獲得目的菌的分類地位及其近緣系統發育地位。

1.7 放線菌的耐受特性研究

1.7.1 放線菌的耐酸性研究

菌株發酵采用YEME液體培養基。每組發酵罐分裝1 200 mL培養基，用濃鹽酸和1 mol/L NaOH溶液分別調節pH值至3.0、4.3、5.6和7.0。脫脂棉堵住發酵罐各開口，121 ℃滅菌30 min后使用。控制發酵溫度為28 ℃，攪拌轉速100 r/min，通氣流量(經空氣過濾器)25 L/h。每隔12 h取1次樣，每次取樣25～30 mL。

試驗以菌體干重法分析菌株生長情況[23]。準確吸取25 mL發酵液樣品5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，帶管于80 ℃烘干至恒重(2次稱量差<0.002 g)。

1.7.2 放線菌的乙醇耐受性研究

用無菌的無水乙醇調節發酵液酒精度至2%vol、4%vol、6%vol和8%vol，其余操作同1.7.1。

1.8 揮發性產物分析

1.8.1 放線菌液態培養

分別按2%接種量進行接種，于28 ℃條件下培養5 d(液態培養需將轉速調至120 r/min)。每組3個平行，密封瓶口，繼續培養2 d。

1.8.2 放線菌固態培養

每瓶50 g固態發酵培養基，滅菌后，在無菌條件下分別吸取10 mL菌種液，振蕩混勻，28 ℃恒溫培養，每隔24 h振蕩搖勻1次。菌株A1、A2培養5 d后密封瓶口，繼續培養2 d。同時做不添加放線菌菌液的空白試驗組，按相同的條件培養并分析。

1.8.3 發酵液揮發性產物分析

采用頂空固相微萃取法提取發酵液揮發性產物。吸取5 mL發酵液加入頂空瓶中，加入1.5 g NaCl，在60 ℃下平衡10 min后，萃取30 min，進樣口250 ℃解析2 min，進行GC-MS分析[24]。

氣相色譜條件[25]：毛細管色譜柱為J&W 122-7062(60.0 m×250 μm，0.25 μm)；手動分流進樣，分流比為12∶1；進樣口溫度250 ℃；起始溫度60 ℃，維持2 min，然后以5 ℃/min升溫至200 ℃，維持 1 min，再以20 ℃/min升溫至250 ℃，維持2 min；以He為載氣，流速為1 mL/min。

質譜條件[25]：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，恒壓10 Pa，質量掃描范圍20～550 amu。

1.8.4 燕麥固態發酵醅揮發性產物分析

采用頂空固相微萃取法提取燕麥固態發酵醅的揮發性成分。稱取燕麥醅5.0 g/瓶，并加入5 μL 2 004.5 mg/100mL的乙酸丁酯標品進行半定量分析。于60 ℃恒溫條件下平衡10 min，后續萃取、分析方法及步驟均同1.8.3。

2 結果與分析

2.1 窖泥細菌多樣性分析

對測序數據利用Mother軟件按97%歸類，劃分OTU，得到稀釋曲線，見圖2，可看出，樣品稀釋曲線隨測序數目的增大而趨于平穩，說明取樣合理，數據有效。將細菌OUT分類按門和目進行統計，結果如圖3所示。發現該窖泥樣品含有豐富的放線菌，含(87±30)個OTUs，占(10.7±3.4)%，僅次于厚壁菌門(Firmicutes)的(42.5±3.0)%和未分類(Unclassified)的(28.6±0.6)%。進一步分析數據，發現放線菌主要分布于未分類(24±7)個OTUs、鏈霉菌亞目(Streptomycineae)(21±7)個OTUs、科里氏桿菌亞目(Coriobacterineae)(19±6)個OTUs、雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)8±3個OTUs、小單孢菌亞目(Micromonosporineae)(7±3)個OTUs、丙酸桿菌亞目(Propionibactrineae)(6±2)個OTUs、另有微球菌亞目(Micrococcineae)(4±2)個OTUs。由窖泥樣品中放線菌群落結構的分析結果可以看出，該窖泥中放線菌物種豐富，鏈霉菌亞目(Streptomycineae)是其中的絕對優勢菌群，與王濤等[26]的研究結果一致。對比劉茂軻等[27]、譚崇堯等[28]、劉延波等[29]的研究結果，發現本試驗所得到的放線菌種屬類更為豐富。首次從濃香型白酒窖泥中分析出Coriobacterineae、Micrococcineae、Bifidobacteriales、Propionibactrineae、Micromonosporineae。

圖2 窖泥樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve in pit mud

圖3 放線菌多樣性分布圖Fig.3 Distribution map of actinomycetes diversity

2.2 放線菌的分離與鑒定

2.2.1 形態鑒定

由原位培養基從窖泥中篩選得到的菌株，經純化培養后，對具有典型放線菌菌落特征的菌株觀察菌落大小、對比生長速度、嗅聞香味，最終篩選出2株具有特殊香氣的菌株，分別編號為A1、A2，對菌落形態觀察見圖4，鏡檢觀察結果見圖5。

由圖4可知，A1菌落表面干燥，不透明，表面有絲絨感；菌落與培養基結合緊密，培養時間較長后可刮取到粉狀菌體，反面呈黑褐色，產可溶性色素。菌株A2較A1生長緩慢，菌落細小，顏色較淺。正反顏色基本一致，不產可溶性色素。

由圖5可知均有發育良好的分枝狀氣生菌絲，基內菌絲發達。孢子在鏡檢結果中呈透明狀，A1可見成堆或排列成串的孢子，A2氣生菌絲分枝較多，可見少量散落的或成串的孢子。由鏡檢結果和菌落形態初步鑒定A1、A2均為放線菌。

a-A1菌落圖;b-A2菌落圖圖4 兩株菌的菌落形態Fig.4 Colony morphology of 2 strains

a-A1氣生菌絲;b-A2氣生菌絲圖5 兩株菌氣生菌絲鏡檢圖(100×)Fig.5 Microscopic examination of aerial mycelium of the 2 strains

2.2.2 生理生化試驗

本試驗工作僅選取若干組與白酒釀造有一定相關性的理化特征進行試驗，結果見表1。試驗發現，菌株A1僅H2S的產生呈現陰性，其余試驗均呈陽性，因此推測A1可能有產蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶能力。A2僅淀粉水解呈現陽性，其余試驗均呈陰性，由此推測菌株A2可能有產淀粉酶能力。這些酶可使原料中的大分子物質分解以供窖池中微生物進一步發酵利用。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)[30]和《鏈霉菌鑒定手冊》[31]，菌株A1、A2符合鏈霉菌科鏈霉菌屬生理生化特征。

表1 生理生化試驗結果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments

2.2.3 16S rRNA基因測序及發育分析

將PCR反應原液送上海杰李生物技術有限公司進行純化和測序，測序序列經NCBI數據庫比對獲取最高相似菌株序列，使用MEGA 7.0構建系統發育樹。菌株A1、A2系統發育樹結果如圖6所示。菌株A1與streptomycessampsoniiNRRL B12325、streptomycessampsonii具有最大的序列相似性，達100%，發育樹上處于同一個分支，將菌株A1鑒定為桑氏鏈霉菌(Streptomycessampsonii)，暫時命名為StreptomycessampsoniiA1。菌株A2與Streptomycesrutgersensisstrain NBRC 3727、Streptomycesrutgersensisstrain NBRC 3419具有最大的序列相似性，達99%，且發育樹上處于同一個分支，我們將菌株A2鑒定為魯地鏈霉菌(Streptomycesrutgersensis)，暫時命名為StreptomycesrutgersensisA2。

圖6 鄰接法構建的菌株A1、A2 16S rRNA序列系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain A1 and A2 16S rRNA constructed by adjacency method

2.3 放線菌的耐受性研究

2.3.1 放線菌耐酸性研究

菌株A1、A2的耐酸性結果見圖7。顯然，2株菌均在pH<4.3時生長受到抑制，在pH>4.3時生長良好。窖泥底層和下層的pH值在4.0～5.5，上層在5.5～6.5[29]，因此菌株A1、A2在窖內都具有一定的生存能力，但相比之下，A2對酸性環境更具有耐受性。本試驗以無機酸調節pH，而窖泥自然環境中則主要為有機酸類，菌株在窖內可能具有更佳的耐酸性，但考慮到窖內的厭氧和高乙醇濃度，實際影響可能更為復雜。

2.3.2 放線菌乙醇耐受性研究

圖8為A1和A2在不同濃度乙醇下的生長曲線。菌株A1在2%vol、4%vol、6%vol和8%vol的酒精度下均能生長，但有不同長度的延滯期(8%vol>6%vol>4%vol>2%vol)。而菌株A2不耐受8%vol的酒精度，在6%vol下可以緩慢生長，在4%vol和2%vol生長情況相近。總之，菌株A1、A2都可以耐受6%vol及以下的酒精度，酒醅中的酒精度一般在3%vol～6%vol[33]，所以2株菌在窖內的酒精環境下具有一定生存能力。

A-A1；B-A2圖7 A1、A2的耐酸性生長曲線Fig.7 Growth curves of the strain of A1，A2 in the environment of different pH

a-A1；b-A2圖8 A1、A2的乙醇耐受性生長曲線Fig.8 Growth curves of the strain of A1、A2 in the environment of different ethanol concentration

2.4 揮發性產物研究

2.4.1 菌株在液態培養條件下揮發性產物分析

經譜庫NIST檢索和資料分析，A1和A2在液態培養條件的產物分別見表2和表3。菌株A1在液態培養條件可產約35.030%的萜烯類物質，33.855%的土臭素(gesomin，GSM)以及5.721%的多菌靈類似物N-苯并咪唑-2-基氨基甲酸甲酯。此前，杜海從釀造環境中篩選出了5株產GMS菌株，鑒定均為鏈霉菌屬[34]。菌株A2能夠產生多種酯類，其中己酸乙酯具有較高的相對含量(5.384%)。同樣地，A2在液態條件下能產萜烯類物質(3.327%)和多菌靈類似物(1.788%)，以及少量具有苦杏仁、櫻桃及堅果香的苯甲醛。

表2 A1發酵液主要揮發性成分Table 2 The main volatile components of the fermentation broth of A1 strain

表3 A2發酵液主要揮發性成分Table 3 The main volatile components of the fermentation broth of A2 strain

2.4.2 菌株在固態培養條件下揮發性產物分析

經譜庫NIST檢索和資料分析，放線菌菌株A1、A2在固態培養條件下其主要揮發性產物分別見表4和表5。

表4 菌株A1燕麥醅主要揮發性成分Table 4 The main volatile components of the fermented Oatmeal of A1 strain

表5 菌株A2燕麥醅主要揮發性成分Tab.5 The main volatile components of the fermented Oatmeal of A2 strain

由表4可知，與液態培養條件下相比，菌株A1在固態培養條件下能產生更多種萜烯類物質,同樣地能產較高含量的GSM,達5.64 ng/g。由表5可知，菌株A2在固態培養條件下，能夠檢測出大量醇類物質(51.08 ng/g)、酮類物質(44.60 ng/g)和吡嗪類物質(7.84 ng/g)，其中醇類物質以2,3-丁二醇為主，達(25.10±0.11) ng/g；酮類物質以3-羥基-2-丁酮為主，達(44.48±0.40)ng/g；吡嗪類以2,3,5,6-四甲基吡嗪為主，達(5.26±0.18)ng/g。2,3-丁二醇可轉化為3-羥基-2-丁酮，因此A2產高含量的2,3-丁二醇，也一定程度上表明了會有高含量的3-羥基-2-丁酮[35]。此前，杜海[34]研究發現鏈霉菌會生成堿性的吡嗪類物質調節周圍生產環境。總的來說，菌株A1在固、液態條件下都以產GMS和萜烯類物質為主，菌株A2在液態條件下具有較強產酯能力，在固態條件下主產酮類、醇類以及吡嗪類物質。與現有報道相比，揮發性產物含量不突出，但尚未見報道從濃香型窖泥中分離出主要產萜烯類、2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、四甲基吡嗪的放線菌。

3 討論

本研究對窖泥樣品的微生物群落結構進行分析，作為分離放線菌的參考和指導，分析結果擴大了窖泥放線菌的種屬范圍。采用原位培養法對放線菌進行分離，分離所得2株菌均為鏈霉菌亞目(Streptomycineae)，可能是由于試驗僅挑取了有典型放線菌菌落特征的菌株，忽略了非典型的放線菌，也可能是由于原位培養裝置只富集了仍有生長代謝活動的菌株，導致分離得到的菌株較少。

2株菌在固、液態培養條件下產物有較大差異，因為這些物質多為次級代謝產物，微生物具有多種次級代謝途徑的潛能，不同培養基或者不同培養方式影響著菌株的次級代謝產物種類及含量[36]，如PUDER等[37]分別采用燕麥培養基和豆粉培養基獲得試驗放線菌的同種類型的不同化合物。從白酒中的美拉德反應[38]角度，菌株A1、A2在液態條件下生成的萜烯類物質，可與乙醇在醋酸的促進下生成原羰基化合物(醛、酮、羧酸及羧酸衍生物)，因此固態實驗中，A1可生成多種酮類物質以及A2可生成多種酮類、醇類、吡嗪類物質可能是萜烯類物質轉化而來。菌株A1產生的GSM與二甲基異茨醇(2-methyl isoborneol，MIB)是飲水中最常出現的土霉異味的2個主要來源[39]。GMS可引起白酒產生糠味，是影響清香型白酒風味主要原因[40]，因此在投入生產中應注意改善工藝，避免影響白酒風味。對于其產生的萜烯類物質，常見于植物的揮發油中，具有一定的藥理功效[41]。菌株A2產生的3-羥基-2丁酮，又名乙偶姻，是一種重要的食用香料，具有強烈的奶油、脂肪樣香氣，高度稀釋后有令人愉快的奶香氣，是白酒的重要的香味成分[42]。其中2,3-丁二醇是一種重要的醫藥成分，在白酒中可單獨用做香料，改善白酒風味，也可以轉化為3-羥基-2-丁酮[35]。四甲基吡嗪是白酒中重要的香氣化合物，且具有藥理功能，被認為是中國白酒中的健康功能因子。有動物試驗表明，四甲基吡嗪可以修復酒精引起的肝細胞損傷和腦神經損傷[43-44]。由此可見，菌株A2可深入研究，提高其物質產量后加以運用。

對于放線菌在濃香型白酒窖泥中的功能，研究還不夠深入，但其應用前景很大，比如可用于生產人工窖泥等方面。在開發放線菌多種功能性產品的同時，需對菌種本身了解充分再加以利用，這還需要不斷深入探究。