黃瓜貯藏中微生物信息三維熒光判別及其數(shù)量監(jiān)控模型構(gòu)建

劉雪茹，李 欣，殷 勇，于慧春，袁云霞，李孟麗

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

黃瓜是世界范圍內(nèi)普遍栽培的重要蔬菜作物，以其豐富的營養(yǎng)、獨特的風(fēng)味和多樣的食用方式而深受人們喜愛，在人們的日常生活中占據(jù)重要的地位[1]。但其生長周期短，采摘后不易貯藏，常溫下果皮會逐漸變黃，果肉發(fā)白變糠，迅速軟爛腐敗，呈現(xiàn)出不同性狀的侵染性病害特征，造成食用品質(zhì)大幅下降[2]。黃瓜腐敗伴隨的各種理化反應(yīng)與微生物增殖密切相關(guān)，微生物量成為影響黃瓜品質(zhì)的重要因素。因此，以微生物分析為基礎(chǔ)，融合計算機信息技術(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析[3]，通過研究黃瓜表面微生物在不同貯藏條件下的特征信息，可實現(xiàn)對微生物含量的快速檢測，以數(shù)據(jù)驅(qū)動實現(xiàn)應(yīng)急響應(yīng)，探尋建立黃瓜腐敗變質(zhì)的監(jiān)控方法，有助于黃瓜后期的貯藏管理及后續(xù)的加工處理工作[4]。

熒光光譜技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新型分析檢測技術(shù)，可用于控制食品品質(zhì)、鑒別食品真?zhèn)巍⒎治鍪称贩N類、追溯食品來源、檢測藥物殘留等，在食品安全領(lǐng)域有著廣闊的運用前景[5]。前期研究結(jié)果表明，三維熒光光譜雖然可獲取豐富的樣本信息，但存在噪聲、干擾變量等冗余信息，增加了檢測模型建立的難度[6]。因此，如何對全譜數(shù)據(jù)進行分解、選擇特征變量信息，成為熒光信息穩(wěn)健分析的前提。

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是微生物體內(nèi)的主要熒光物質(zhì)，其含有的飽和共軛環(huán)狀結(jié)構(gòu)能發(fā)出天然熒光[7-10]。對細(xì)菌菌株的研究均表明色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸具有獨特的雙峰熒光特征[11-14]，但是由于它們的發(fā)射光譜相互重疊而不能直接測定[15]，且苯丙氨酸的熒光強度極弱[16]。因此，在貯藏過程中，擬采用三維熒光光譜儀對黃瓜表面微生物樣本信息進行采集，根據(jù)核心一致診斷（core consistency diagnosis，CORCONDIA）法確定組件數(shù)，通過交替三線性分解（alternating trilinear decomposition，ATLD）算法將光譜分解為不同組件，以微生物主要內(nèi)源熒光物質(zhì)類色氨酸為基礎(chǔ)選擇其中有效組件，通過區(qū)域積分法獲得相應(yīng)區(qū)域積分值，并通過多元逐步回歸構(gòu)建微生物數(shù)量與各區(qū)域積分值的函數(shù)表達(dá)式，進而構(gòu)建了微生物數(shù)量變化情況的監(jiān)控模型，為實現(xiàn)黃瓜貯藏過程中品質(zhì)變化的快速監(jiān)控及腐敗預(yù)判提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年12月2日從河南省洛陽市大張超市購買同一批次黃瓜500 kg，品種為‘博新201’，新鮮程度較一致。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary Eclipse型熒光光譜儀美國安捷倫公司；H1650-W型醫(yī)用離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DNP-9022型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司；XW-80A型漩渦混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃瓜的貯藏與處理

由于黃瓜在實際運輸、貯藏和銷售過程中多處于常溫環(huán)境，同時考慮到貯藏時間僅影響腐敗進程，因此為縮短貯藏實驗時間，將黃瓜分層架藏于常溫貯藏庫中。溫濕度記錄儀顯示貯藏室基本維持在溫度（15±1）℃、相對濕度（65±1）%條件下，無較大波動。每天隨機選取5 根黃瓜進行三維熒光信息檢測和微生物平板培養(yǎng)計數(shù)。為確保實驗覆蓋整個黃瓜貯藏進程，共采集了15 d的貯藏數(shù)據(jù)以用于研究分析。

1.3.2 熒光信息采集

每天從貯藏庫的不同貨架層隨機選取5 根黃瓜作為檢測樣本，將塑料模具固定于黃瓜頭部，露出10 cm2表皮面積進行采樣（黃瓜腐敗多從頭部開始）。用無菌離心管盛裝3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的滅菌生理鹽水，將無塵布棉簽浸潤生理鹽水后，以45°傾斜于黃瓜表面，平穩(wěn)緩慢地擦拭取樣。收集取樣后的棉簽頭置于離心管中，用振蕩器混勻1 min后獲得微生物原液。為避免菌液濃度過高導(dǎo)致檢測器飽和[14]，用生理鹽水將原液稀釋5 倍，制成處理組待測菌懸液，并重復(fù)上述步驟，用未采樣棉簽頭制作空白對照。

將待測樣品注入微量石英比色皿，放入熒光光譜儀樣品池掃描獲取三維熒光數(shù)據(jù)，激發(fā)波長為200～400 nm，發(fā)射波長為260～550 nm，采樣波長間隔為5.00 nm，電壓為800 V，掃描速率為1 200 nm/min。

1.3.3 樣本表面微生物的培養(yǎng)和計數(shù)

為保持微生物培養(yǎng)與熒光信息采集的一致性，將用于熒光信息采集的待測菌懸液稀釋到覆蓋適合計數(shù)范圍的濃度，平行涂布3 個平板。倒置于37 ℃恒溫箱，培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)和采樣面積換算出黃瓜表面單位面積微生物菌落數(shù)，參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[17]，結(jié)果用CFU/cm2表示，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 樣本熒光數(shù)據(jù)預(yù)處理

對初始三維熒光數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，采用基于Delaunary的三次多項式插值方法，以鄰近區(qū)域的數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)進行三維插值，以消除光譜中瑞利散射的影響。然后對三維光譜數(shù)據(jù)進行Savitzky-Golay（SG）多項式曲面平滑降噪處理[18]。

1.4.2 CORCONDIA法確定組件數(shù)

為分離復(fù)雜化合物中的光譜重疊、量化整個體系中主要物質(zhì)的濃度，采用CORCONDIA法確定合適的因子數(shù)。CORCONDIA法由Bro等[19]提出，通過計算平行因子模型中的超對角矩陣與最小二乘擬合陣之間的相似程度（即核心一致值）來估計組件數(shù)。公式（1）為核心一致性函數(shù)表達(dá)式。

式中：i、j、k分別代表三維熒光矩陣對應(yīng)的第i個激發(fā)波長、第j個發(fā)射波長和第k個混合物樣本；gijk為用Tucker3模型得到的核心矩陣的元素；tijk為三維熒光矩陣的單位超對角矩陣元素；N是模型中組件的數(shù)量。

當(dāng)N小于或等于正確組件數(shù)時，函數(shù)值接近于100%，模型符合三線性；當(dāng)N大于正確組件數(shù)時，函數(shù)值接近于零甚至為負(fù)數(shù)，則該模型偏離三線性。按照CORCONDIA分析原理，當(dāng)取某組件數(shù)時，若函數(shù)值小于60%，那么該組件數(shù)減一即為體系的最佳組件數(shù)[20]。

1.4.3 ATLD算法分解三維數(shù)據(jù)

ATLD算法[21]是一種具有迭代特點的二階張量校正方法，具有快速收斂性和對估計組件數(shù)量不敏感的優(yōu)點。利用交替最小二乘原理，借助基于奇異值分解的廣義逆計算方法[22]，通過交替最小化目標(biāo)函數(shù)，實現(xiàn)三維數(shù)據(jù)分解。

1.4.3.1 三線性成分模型

假設(shè)伴隨黃瓜貯藏進程的測試樣本數(shù)為K，激發(fā)波長數(shù)為I，發(fā)射波長數(shù)為J，將其收集到三維響應(yīng)矩陣XIJK中。若該立體矩陣XIJK滿足式（2）中三線性成分模型，則可被唯一分解為3 個基礎(chǔ)矩陣（相對激發(fā)強度光譜陣A、相對發(fā)射強度光譜陣B、樣本相對濃度陣C）和三維殘差矩陣E。

式中：ain是相對激發(fā)強度光譜陣A（I×N）的元素；bjn是相對發(fā)射強度光譜陣B（J×N）的元素；ckn是貯藏過程樣本相對濃度陣C（K×N）的元素；eijk是三維殘差數(shù)陣E（I×J×K）元素；xijk是三維響應(yīng)數(shù)陣XIJK（I×J×K）中的元素；N為對體系做出貢獻的總組件數(shù)，包括主要感興趣物質(zhì)、溶液背景（生理鹽水和黃瓜表面雜質(zhì)）和儀器噪聲的干擾[23]。

1.4.3.2 ATLD算法

三線性成分模型可分別沿著激發(fā)光譜通道i，發(fā)射光譜通道j和樣本數(shù)k分解為3 個切片矩陣Xi..、X.j.和X..k，因此三線性成分模型可以表示為以下3 個等價方程（式（3）～（5））[24]。

式中：a（i）、b（j）、c（k）分別是相對激發(fā)強度光譜陣A的第i行向量、相對發(fā)射強度光譜陣B的第j行向量、相對濃度陣C的第k行向量；diag（.）表示對括號中方陣取對角元素。

上述3 個向量可由交替最小化損失函數(shù)（即殘差矩陣元素的平方總和）得出[25]，其函數(shù)表達(dá)式如式（6）所示。

在迭代過程中不斷更新矩陣A、B和C，當(dāng)損失函數(shù)σ收斂到預(yù)設(shè)值ε時，最終分解完成。收斂準(zhǔn)則為式（7）。

式中：ε取10-6；m為迭代次數(shù)。

1.4.4 熒光區(qū)域積分

由ATLD算法可獲得與微生物內(nèi)源熒光信息相關(guān)的組件，將其重新構(gòu)成單獨的三維熒光光譜矩陣。采用優(yōu)化的自適應(yīng)Simpson積分算法[26]，根據(jù)不同的激發(fā)和發(fā)射波長，劃分為內(nèi)源熒光團形成的積分區(qū)間D，進行二重積分?jǐn)?shù)值計算，求出熒光區(qū)域i的體積積分值Фi（式（8）），同時將各區(qū)域熒光積分進行標(biāo)準(zhǔn)化處理（式（9））[27]，保證精度的同時提高計算效率。

式中：Фi為熒光區(qū)域i的積分體積/（au·nm2）；Фi,n為標(biāo)準(zhǔn)化區(qū)域積分值；x為激發(fā)波長/nm；y為發(fā)射波長/nm；f（x,y）為激發(fā)-發(fā)射波長對應(yīng)的熒光強度（au）；D為內(nèi)源熒光團積分區(qū)間，其中a≤x≤b為激發(fā)波長范圍；c≤y≤d為發(fā)射波長范圍；MFi為該區(qū)域所占面積與總區(qū)域面積比值的倒數(shù)。

1.4.5 逐步回歸模型的構(gòu)建

將各區(qū)域熒光標(biāo)準(zhǔn)積分值作為自變量X，黃瓜表面微生物計數(shù)結(jié)果作為因變量Y，進行逐步回歸分析[28]。此外采用二元四次逐步回歸，并考慮各因素之間的交叉項，逐個剔除了不顯著因素，選出最佳回歸方程，構(gòu)建黃瓜表面微生物數(shù)量回歸檢測模型。評價方程的變量對Y解釋能力的指標(biāo)為決定系數(shù)R2，其范圍為[0，1]，越接近1，說明模型對數(shù)據(jù)的擬合越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本表面微生物的計數(shù)結(jié)果

伴隨貯藏時間不斷調(diào)整黃瓜表面菌液的稀釋倍數(shù)，表1為微生物平板培養(yǎng)的計數(shù)結(jié)果。圖1A為貯藏過程中微生物的變化曲線，可以更加直觀地反映其變化規(guī)律。

表 1 貯藏過程中微生物培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果Table 1 Microbial counts on cucumber during storage

圖 1 黃瓜貯藏過程中表面單位面積平均微生物菌落數(shù)（A）、表觀狀態(tài)（B）及對應(yīng)微生物的培養(yǎng)狀態(tài)（C）Fig. 1 Average microbial count (A), appearance (B) and colony morphology (C) on cucumber samples during storage

由圖1可知，在貯藏期間黃瓜表面菌落數(shù)呈現(xiàn)“S”型曲線增長，但由于不能保證黃瓜隨機取樣的絕對均勻性，導(dǎo)致品質(zhì)接近期間微生物菌落數(shù)略有波動，但整體呈現(xiàn)明顯上升趨勢。貯藏前6 d，黃瓜表面微生物數(shù)量增長緩慢，僅為初始菌落數(shù)的9.1 倍，黃瓜表皮色澤青翠，頂花帶刺，切面新鮮；從第7天開始，微生物數(shù)量大幅度增加，達(dá)初始菌落數(shù)的77.52 倍，黃瓜表面色澤墨綠，瓜刺部分脫落，頂花萎蔫，切面較新鮮，個別黃瓜由于搬運過程中擦傷開始出現(xiàn)腐敗；至第12天，微生物數(shù)量達(dá)初始的184.65 倍，瓜色褪綠，瓜刺完全脫落，切面變白，貯藏架各層均出現(xiàn)不同程度腐敗。

根據(jù)黃瓜表面微生物培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果和感官變化的綜合評價，判斷這批黃瓜在第7天開始腐敗。結(jié)果表明，貯藏過程中黃瓜品質(zhì)變化與微生物數(shù)量及其波動幅度具有一定關(guān)聯(lián)，微生物增殖是造成黃瓜腐敗的主要因素，微生物數(shù)量越多，黃瓜越接近腐敗。因此，微生物數(shù)量預(yù)測是實現(xiàn)黃瓜貯藏過程中腐敗進程監(jiān)控和采取處理措施的重要依據(jù)。

2.2 熒光數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

圖 2 數(shù)據(jù)預(yù)處理前（A）、后（B）的三維熒光光譜圖Fig. 2 Comparison of 3D fluorescence spectral data before (A) and after (B) preprocessing

圖2A為黃瓜表面微生物懸液的原始三維熒光圖譜，圖2B為去除瑞利散射并經(jīng)SG平滑處理后的三維熒光圖譜。通過對比發(fā)現(xiàn)，原始三維熒光光譜存在一定噪聲信號，且光譜中的特征峰受到二級瑞利散射的嚴(yán)重干擾。在去除了瑞利散射，且經(jīng)過SG平滑處理后有效減少了原始光譜存在的噪聲干擾，使微生物懸液的特征峰更加明顯清晰，為后續(xù)進一步的分析工作奠定了良好基礎(chǔ)。

2.3 組件數(shù)確定

在對黃瓜表面微生物菌懸液中主要熒光物質(zhì)進行判別之前需要選擇正確的組件數(shù)，因此，首先采用CORCONDIA法對預(yù)處理之后的三維熒光數(shù)據(jù)進行組件數(shù)估計。圖3為取組件數(shù)為1～7時對應(yīng)的核心一致值。由核心一致診斷可知，隨組件數(shù)的增加，核心一致值逐漸降低。當(dāng)組件數(shù)取1～2時，核心一致值較高，接近于100%；當(dāng)組件數(shù)取3～4時，核心一致值略有下降，但始終大于80%；而當(dāng)組件數(shù)取5時，核心一致值從較高水平驟降低至40%左右，遠(yuǎn)小于60%。因此，從圖3結(jié)果可以判斷出微生物菌懸液樣品的最佳組件數(shù)為4。

圖 3 CORCONDIA法確定組件數(shù)Fig. 3 Number of components determined by core consistency diagnosis

2.4 微生物信息判別

圖 4 ATLD算法獲得的各組件相對激發(fā)強度光譜圖（A）、相對發(fā)射強度光譜圖（B）和相對濃度圖（C）Fig. 4 Relative excitation intensity spectra (A), relative emission intensity spectra (B), and relative concentration (C) of each component obtained by ATLD algorithm

采用ATLD算法按組件數(shù)4對三維熒光矩陣進行分解，得到各個組件的相對激發(fā)強度光譜圖、相對發(fā)射強度光譜圖和貯藏過程各組件的相對濃度。由圖4A可知，組件1和組件3均在特定激發(fā)波長范圍內(nèi)具有明顯雙峰結(jié)構(gòu)，且略有交疊；由圖4B可知，組件1和組件3在特定發(fā)射波長范圍處具有熒光單峰；比較圖4C中各組件相對濃度，發(fā)現(xiàn)組件1所代表的物質(zhì)具有較高熒光量子產(chǎn)率，且伴隨貯藏進程有較大波動。

表 2 組件熒光峰范圍及其對應(yīng)種類Table 2 Wavelength ranges and types of component fluorescence peaks

分析光譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，如表2所示，組件1的兩個熒光峰分別位于激發(fā)/發(fā)射波長即λEx/λEm＝225 nm/342 nm和λEx/λEm＝275 nm/342 nm附近，與類色氨酸的低激發(fā)熒光峰（λEx＝220～230 nm/λEm＝320～350 nm）和高激發(fā)熒光峰（λEx＝270～280 nm/λEm＝320～350 nm）的位置相符，且相對濃度較高，這表明該組件代表類色氨酸；組件2雖然沒有明顯的熒光峰，但富含一定的信息量，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與黃瓜表面附帶的土壤腐殖質(zhì)、農(nóng)藥殘留和可溶性微生物代謝產(chǎn)物等構(gòu)成的復(fù)雜溶液背景熒光有關(guān)；組件3的兩個熒光峰分別位于λEx/λEm＝220 nm/290 nm和λEx/λEm＝260 nm/290 nm附近，分別與類酪氨酸低激發(fā)類熒光峰（λEx＝220～230 nm/λEm＝300～310 nm）和高激發(fā)類熒光峰（λEx＝270～280 nm/λEm＝300～310 nm）的波長位置接近，表明組件3代表類酪氨酸；組件4無明顯熒光峰，且含有負(fù)值，在貯藏過程中相對濃度無較大波動，信息含量低，視為儀器噪聲。由于組件1與類色氨酸的指紋圖譜對應(yīng)精準(zhǔn)，相對濃度高，信息含量大且受其他成分信號干擾影響小，后續(xù)著重對組件1的熒光光譜進行分析處理。

2.5 微生物信息表征

為進一步細(xì)化光譜信息，充分刻畫各組件中特征峰的變化情況，采用熒光區(qū)域積分計算方法，參考表2中類色氨酸的熒光峰范圍，對分離出的組件1（圖5）中低激發(fā)類色氨酸區(qū)域I和高激發(fā)類色氨酸區(qū)域II進行積分計算，獲得積分結(jié)果見圖6。

由標(biāo)準(zhǔn)化區(qū)域積分值發(fā)現(xiàn)，用于表征微生物信息的類色氨酸的熒光總量伴隨黃瓜貯藏進程不斷增加，其中低激發(fā)類色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域積分值遠(yuǎn)大于高激發(fā)類色氨酸，且兩者具有相似的變化趨勢。

圖 5 組件1的特征三維熒光光譜圖Fig. 5 Characteristic 3D fluorescence spectra of component 1

圖 6 類色氨酸的區(qū)域積分值Fig. 6 Regional integral values of tryptophan-like fluorescence

2.6 微生物數(shù)量監(jiān)控模型構(gòu)建結(jié)果

為建立微生物內(nèi)源熒光信息與微生物數(shù)量之間的關(guān)系，從黃瓜貯藏過程采集的15 d測試樣本（共18 個）中隨機選取17 個樣本，以微生物計數(shù)結(jié)果作為因變量Y（微生物數(shù)量范圍為5 000～1 182 000 CFU/cm2），對應(yīng)組件1特征光譜中的高激發(fā)類色氨酸標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域積分值X1和低激發(fā)類色氨酸標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域積分值X2作為自變量，采用二元四次逐步回歸方法建立微生物數(shù)量監(jiān)控模型（ 為預(yù)測值），剩余1 個樣本進行模型檢驗。式（10）為所構(gòu)建的回歸方程。

結(jié)果表明，在顯著水平α＝0.05下，R2＝98.309 8%、F＝58.166 1＞F1-0.05＝3.74、P＝2.741 9×10-6＜0.05、均方根誤差＝69 218.5，檢測誤差較小且決定系數(shù)較高。校驗樣本的預(yù)測結(jié)果為779 828 CFU/cm2，而該樣本代表的實際微生物菌落數(shù)為788 000 CFU/cm2，相對誤差為1.037 1%。因此，該結(jié)果可有效證明：根據(jù)構(gòu)建的二元四次逐步回歸模型可預(yù)測出黃瓜表面單位面積腐敗微生物數(shù)量，實現(xiàn)復(fù)雜體系中微生物的定量分析。

結(jié)合黃瓜在不同貯藏階段表面微生物數(shù)量的變化特點，發(fā)現(xiàn)在貯藏第7天黃瓜開始出現(xiàn)小批量腐敗，至第12天黃瓜大規(guī)模腐敗變質(zhì)，均伴有以熒光信息為載體的微生物數(shù)量的激增。因此，根據(jù)三維熒光光譜分析技術(shù)，通過建立微生物數(shù)量變化的監(jiān)控模型，對黃瓜貯藏過程微生物的數(shù)量和增值情況進行實時監(jiān)控，可為貯藏過程中黃瓜品質(zhì)變化的快速監(jiān)控及腐敗預(yù)判提供參考的依據(jù)。

3 結(jié) 論

本實驗將三維熒光光譜檢測技術(shù)應(yīng)用于黃瓜表面微生物數(shù)量的快速檢測，采集貯藏過程中黃瓜表面微生物懸液的熒光數(shù)據(jù)，在預(yù)處理的基礎(chǔ)上，采用CORCONDIA法估計其組件數(shù)為4；運用ATLD算法提取4 個組件的特征光譜，判別其中與微生物信息相關(guān)的組件，并結(jié)合熒光區(qū)域積分法進一步對感興趣區(qū)域進行定量分析；同時，運用二元四次逐步回歸方法建立區(qū)域積分值與微生物數(shù)量的監(jiān)控模型。結(jié)果表明，ATLD算法分離出的組件1和組件3具有明顯雙峰結(jié)構(gòu)，其特征峰位置符合類色氨酸和類酪氨酸特定熒光峰范圍，是微生物主要內(nèi)源熒光團。因組件3所代表的類酪氨酸熒光強度低且變化不明顯，故針對代表類色氨酸的組件1采用熒光區(qū)域積分法計算其高激發(fā)類色氨酸和低激發(fā)類色氨酸區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)熒光區(qū)域積分值，并構(gòu)建有效的微生物數(shù)量監(jiān)控模型。本研究結(jié)果表明，采用ATLD算法對復(fù)雜溶液中微生物相關(guān)目標(biāo)物質(zhì)進行定性和定量分析是十分有利的，能夠有效利用三維熒光數(shù)據(jù)的豐富信息，避免了化學(xué)分離和微生物培養(yǎng)計數(shù)過程中耗時、耗材、操作繁瑣的問題。有助于實現(xiàn)黃瓜貯藏過程中品質(zhì)變化的快速監(jiān)控，并為預(yù)判黃瓜腐敗提供了依據(jù)。